185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
1 185 668 2 Mint a fentebb említettük, a találmány szerinti eljárást 7 és 10,5 közötti pH-értéken, előnyösen 7,5—10,5 pH-n vitelezzük ki. Az előnyős pH-érték gyakran igen szűk pH-intervallumon belül van, ami a használt enzim különböző enzimaktivitásainak pH-optimumától és pH-minimumától függ. A pH-t úgy kell megválasztani, hogy az aktivitások az előzőeknek megfelelően egymással egyensúlyban legyenek. Enzimként CPD— Y-t használva a pH-érték előnyösen 7,5—10,5, különösen előnyös a 9,0—10,5 érték, amint azt később megmagyarázzuk. Ha az inzulin-amid köztiterméket kívánjuk izolálni, az előnyös pH-tartományon belüli alacsonyabb pH-értékek, vagyis a pH 7,5 körüli értékek különösen megfelelőek. A választott pH-t előnyösen az egész kapcsolási reakció alatt állandó értéken kell tartani, majd a termék kicsapására vagy a védőcsoportok lehasítására meg lehet változtatni. Választhatunk olyan pH-t, hogy az enzim amidáz aktivitást mutasson, és emellett a képződött inzulin-amid ne csapódjon ki, ezáltal előnyösen résztvegyen a kívánt inzulin egy lépésben végbemenő képződésében. A pH-t úgy is megválaszthatjuk, hogy az enzim túlnyomóan peptidáz aktivitást mutasson, és a stabil inzulin-amid köztitermék képződése kerüljön előtérbe. A pH kívánt értéken tartását a reakcióközegbe vitt, megfelelő pH-tartományt biztosító alkalmas pufferoldattal biztosíthatjuk, például hidrogén-karbonát pufferrel. A pH-értéket úgy is biztosíthatjuk, hogy a reakció folyamán savat, például sósavat vagy bázist, például nátrium-hidroxidot adagolunk a reakcióelegybe. Ezt a műveletet pH-sztát közbeiktatásával kényelmesen elvégezhetjük. A fenti, valamint a Carlsberg Res. Comm. 44, 37 (1979) és 45, 237 (1980) irodalmi helyen található adatok ismeretében egy szakember ki tudja választani a legmegfelelőbb reakciókörülményeket, különös tekintettel a pH-ra, amelyek között a különböző enzimaktivitások (amidáz, peptidáz, észteráz, karboxipeptidáz és peptidil-aminosavamid-hidroláz) legjobban hasznosíthatók, az inzulin szubsztrát-komponenstől, az amin-komponenstől és attól függően, hogy köztitermék vagy a végtermék keletkezését tűztük ki célul. Általában a kedvező pH-tartományon belül az alacsonyabb pH-értékeknél az inzulin-amid köztitermék keletkezése és kicsapódása kerül előtérbe, míg a magasabb pH-értékeknél a karboxipeptidáz enzim kifejezettebb amidáz aktivitása következtében az amidkötés elhasad és inzulin keletkezik. A körülményeket az enzim koncentrációja, a reakcióidő és a többi körülmények is befolyásolják. A reakciót vizes közegben hajtjuk végre, amely kívánt esetben 0—50 térfogata« szerves oldószert is tartalmazhat. Előnyös szerves oldószerek az alkanolok — például metanol és etanol —, a glikolok — például etilénglikol vagy polietilénglikolok —, a dimetilformamid, dimetii-szulfoxid, tetrahidrofurán, dioxán vagy dimetoxi-etán. A reakcióközeg összetételének megválasztása különösen a reakciókomponensek és az inzulin-termékek pH-jától, oldhatóságától és hőmérsékletétől és az enzim stabilitásától függ. A reakcióközegben lehet egy olyan összetevő is, ami az enzimet oldhatatlanná teszi, az enzimaktivitás jelentős részének megtartása mellett, ilyen például egy ioncserélő gyanta. Az enzimet ismert módon — például a Methods in Enzymology, Vol. 44, (1976) irodalmi helyen ismertetett módon — immobilizálhatjuk is, például egy térhálósított dextrán vagy agaróz hordozóhoz, szilikagélhez, poliamidhoz vagy cellulózhoz kőivé, vagy poliakjilamidba, alginátba vagy rostokba zárva. Emellett az enzimet kémiailag is módosíthatjuk, hogy megnöveljük a stabilitását vagy enzimatikus sajátságait megjavítsuk. Abban az esetben, ha az inzulin-amid köztitermék kicsapódásának megakadályozása a cél, a reakcióközeg 0—3 mól/1 karbamidot vagy guanidin-hidrokloridoi tartalmazhat. Ez előnyös lehet a pH-értékek szempontjából is, vagy olyan reakcióközegben, ahol az inzulin szubsztrát-komponens oldékonysága korlátozott. A két reakciópartner koncentrációja széles határokon belül változhat, mint azt alább részletezzük. Az inzulin szubsztrát kiindulási koncentrációja előnyösen 0,002—0,05 mól/1, az amin-komponens kiindulási koncentrációja előnyösen 0,05—3 mól/1. Az enzimaktivitás változhat, de a koncentráció előnyösen 10“6—10~4 mól/1, különösen előnyös a 10-5 mói/1 koncentráció. A legelőnyösebb aktivitás többek között a szubsztrátkoncentrációtól, az aminokoncentrációtól.és a reakcióidőtől függ. A találmány szerinti eljárásban a reakcióhőmérséklet előnyösen 20—40 °C. Az egy adott szintézishez legelőnyösebb reakcióhőmérsékletet kísérleti úton lehet meghatározni, de különösen a használt aminkomponenstől és az enzim koncentrációjától függ. Általában 20—30 °C a megfelelő hőmérséklet, előnyöuen 25 °C. 20 °C alatti hőmérsékleteken a reakcióidő túlságosan hosszú, míg 40 °C feletti hőmérsékleteken gyakran az enzim és/vagy a reagensek vagy a reakciótermékek stabilitása jelent problémát. A reakcióidő is hasonlóképpen változhat, a reakció körülményeitől, különösen az enzimkoncentrációtól függ erősen. A reakcióidő a találmány szerinti eljárásban 2—6 óra lehet. Megemlítjük, hogy abban az esetben, mikor aminkonponensként amidot vagy helyettesített amidot használunk, a képződött inzulinról az amid csoportot rendszerint specifikusan kell eltávolítani. Ebből a szempontból a karboxipeptidáz, különösen a CPD— Y nagyon megfelelő, mivel mint fentebb leírtuk, a CPD—Y amidáz aktivitással is rendelkezik pH > 9 értéknél, ugyanakkor karboxipeptidáz aktivitása elhanyagolható. Ugyanilyen okból a karboxipeptidáz általában alkalmazható az -OR3 észtercsoportok lehasítására a keletkezett inzulin-észter köztitermékből, hogy a kívánt, szabad C-terminálist tartalmazó inzulinhoz jussunk. Kiindulási anyagok A sertés inzulint a Nordisk Insulin-laboratóriumtól kaptuk, Koppenhágából. A karboxipeptidáz Y enzimet pékélesztőből (a Carlsberg Breweries kereskedelmi készítménye) izoláltuk, Johansen és munkatársai [Carlsberg Res. Comm. 41, 1 (1976)] affinitás! kromatográfiás módszerének módosításával, a terméket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
