185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
185 668 liofilizált por alakjában kaptuk (10% enzim nátriumcitrátban). Az enzimet felhasználás előtt SephadexR G—25 (1,5x25 cm) oszlopon sómentesítettük, vízzel ekvilibrálva és eluálva. Az enzim koncentrációját spektrofotometriás módszerrel határoztuk meg, E'^sonm“ 14,8. Az enzim-készítmény nem mutatott proteáz A aktivitást Lee és Riordan [Biochem. Biophys. Res. Comm. 85, 1135 (1978)] módszerével vizsgálva. Az L-treonin-amid a Vega-Fox, Arizona, USA terméke, az L-treonin-metil-észter a Fíuka, Svájc, az L-treonin, denzil-klorid, karboxipeptidáz A és a tripszin a Sigma, USA terméke volt. A kromatográfiás anyagok a Pharmacia, Svédország termékei voltak. Az összes többi oldószerek és reagensek a Merck cég, NSZK analitikai tisztaságú termékei voltak. A minosav-anallzis Az aminosav mintákat 6 mól/1 hidrogén-kloridba r 110 °C-on vákuumban 24 órán át hidrolizáltuk és Durrum D—500 aminosav analizátorban vizsgáltuk. Az aminosav-összetéttelt az ismert mennyiségben jelenlévő aszparaginsav és glicin alapján határoztuk meg. A reakciókkal a treonin, lizin, és alanin mutat- - ható csak ki. Ezeknek az aminosavaknak az értéke sertés (emberi) inzulinban a következő volt ; Thr- 1,93 (2,87), Lys-0,97 (0,98) és Alá-2,00 (1,05). Az átalakulatlan sertés inzulin mennyiségét t reakcióelegyben SephadexR G—50-en végzett kroma- ;í tográfia után az inzulin alanin tartalmának analízisé bői határoztuk meg. A kitermelést úgy kapjuk, hog egy adott termék mennyiségét osztjuk a reakcióban felhasznált összes inzulin mennyiségével. Emésztés karboxipeptidáz A-val (2. és 3. példaj 100 pl inzulin vagy inzulin-származékot tartalmazó oldathoz (0,7 mg inzulin vagy inzulin-származék/1 mi 0,1 mól/1 Tris-HCl puffer) (pH 7,5) 10 pg karboxi peptidáz A-t adtunk. Szobahőmérsékleten 6 órán k inkubáltuk, a reakciót azonos térfogatban adott 0.: mól/1 sósavval leállítottuk és a szabaddá vált amino savax mennyiségét aminosav-analízissel meghatároz tűk. Inzulin-származékok enzimatikus emésztése (4. példa, A különböző inzulin-származékok emésztését kar boxipeptidáz A-val vagy karboxipeptidáz Y-nal 0,05 mól/1 Tris pufferben (pH 7,5) szobahőmérsékleten végeztük, körülbelül 1,5 mmól/1 inzulint és 5 pmól/í karboxipeptidázt alkalmazva, a reakcióidő 3 óra volt a CPD—A és 1,5 óra a CPD—Y esetén. Ilyen körülmények között hasadt le a C-terminális aminosavakból a legnagyobb mennyiség. Sósavas savanyítás után az alikvot mennyiségeket közvetlenül az aminosav analizátorba vittük. A különböző inzulin-származékok C-terminális részének aminosav szekvenciáját úgy határoztuk meg, hogy tripszines emésztés után az elegyet denzil-kloriddal (Dnz-klorid) reagáltattuk és a denzil-peptideket azonosítottuk. (Denzil — 5-(dimetil-amino)-l-naftalinszulfanil.) Az inzulin-származékok tripszines emésztését 0,1 mól/1 nátriumhidrogén-karbonát oldatban (pH 8,2) végeztük, 1 mmól/1 inzulint, 40 pmól/1 DPCC-tripszint (DPCC-tripszin: olyan tripszin, amelynek maradék kirnotripszin-aktivitását difenil-karbamoil-kiorid hozzáadásával inaktiváltuk), és 1 órás inkubációs időt alkalmazva. Sertés inzulinnal végzett előkísérletek alapján bizonyítottuk, hogy ilyen körülmények között a B-lánc C-terminális alaninja teljes mértékben szabaddá válik. A szabaddá » vált aminosavakat vagy dipeptideket a következők szerint denziíáltuk: 100 pl tripszinnel emésztett Hegyben a reakciót 100 pl 0,5 mól/1 sósav hozzáadásával _ leállítottuk. Az alikvot részeket szárazra pároltuk és 100 pl 0,1 mól/1 nátrium-hidrogén-karbonátban (pH 8,2) újraoldottuk, 100 pl denzil-kloridot (5 mg/ml aceton) adtunk hozzá és a reakcióelegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A reakcióelegyet ezután nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerrel analizáltuk, Waters folyadékkromatográfiás rendszert alkalmazva, ami egy injektorból (Model U6K), két szivattyúból (Model 6000 A), programozott oldószer-adagolóból (Model 660), ultraibolyadetektorból (Model 450), adat-kiíróból (Waters Data Module) és egy kromatográfiás oszloppal [Waters Radial Paie A (C—18 reverse phase)] felszerelt kompresszor egységből [Waters Radial compression Module (RCM 100)] állt. A következő standard vegyületeket szintetizáltuk: Dnz-AIa-OH, Dnz-Thr-OH, Dnz-Ala-Thr-OH, Dnz-Thr-Thr-OH, Dnz-Thr-NH2, Dnz-Thr-Thr-NH2 és Dnz-Ala-Thr-NH2. Az enzimesen emésztett inzulin denzilezésére fentebb leírt eljárást alkalmazva a fenti származékok közül hármat szintetizáltunk H-Ala-OH-bói H-Thr-OH-ból és H-Thr-NH2-ból. A denziiált dipeptideket Dnz-Ala-OMe-ből és Dnz-Thr-OMeből kiindulva az alábbiak szerint szintetizáltuk: 1 mmól H-Ala-OMe-HCl-ot 0,1 mól/1 NaHCO, oldatban oldottunk, 5 mmól denzil-kloridot adtunk hozzá és a reakcióelegyet 2 órán át inkubáltuk, A Dnz-Ala-OMe-t etil-acetáttal extraháltak az Hegyből, majd az extraktumot szárazra pároltuk. Magas nyomású folyadékkromatográfiás módszerrel bizonyítottuk az elválasztott anyag tisztaságát. Ugyanilyen eljárással állítottuk elő a Dnz-Thr-OMe-t is. A két kapott vegyületet ezután az előzőleg leírt [Widmer és Johansen, Carlsberg Res. Comm. 41, 37 (1979) és Breddam és munkatársai, Carlsberg Res. Comm. 45, 237 (1980)] enzimatikus peptid-szintézis eljárásait alkalmazva H-Thr-OH-hoz kapcsolva Dnz-Ala-Thr-OH-t és Dnz-Thr-Thr-OH-t, H-Thr-NH2-hoz kapcsolva pedig Dnz-Ala-Thr-NH2~í és Dnz-Thr-Thr-NHrt állítottunk Hő, az alábbi körülmények között: 5 mmól/1 szubsztrát, 0,5 mól/1 nukleofil, 0,1 mól/1 KC1, 2 mmól/1 EDTA, 1 pmól/1 CPD—Y, pH 9,0, 10% etanol. Mind a hét denzil-származékot könnyen el lehetett választani HPLC módszerrel, két különböző programot alkalmazva. Az 1. ábra a reakció lefolyását mutatja abban az esetben, mikor sertés inzulint L-treonin-amiddal reagáltatok CPD—Y, mint katalizátor jelenlétében. Az aminosav-analízis eredményét ábrázoljuk az idő függvényében. A 2. ábra hasonló reakció lefolyást mutat, L-treonin-metil-észtert alkalmazva amin-komponensként. 6
