185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
I 185 668 2 A találmány tárgya eljárás a különböző fajokból származó inzulinok B-láncban levő C-terminális aminosav (B—30 aminosav) enzimatikus helyettesítésére. Ismert, hogy a különböző gerincesekből — beleértve az emlősöket és az emberi nemet is — származó inzulinok elsődleges szerkezete különböző. Sanger 1958-ban határozta meg a marha inzulin elsődleges szerkezetét (4. ábra), azóta más gerinces fajokból származó inzulinok elsődleges szerkezetét is felderítették. A leírásban az aminosavak rövidítésére a nemzetközileg elfogadott jelölést használjuk. A IV. táblázatban összesített eredmények szerint a sertés inzulin példája bizonyítja, hogy az egyik láncon belül több helyzetben fordulhat elő aminosav-csere. Azonban bizonyos szerkezeti vonások közösek az összes inzulinban, például a három diszulfid-kötás helyzete, az A-lánc N-terminális szakasza, a C-terrr inális szakasz B—23—B—26 szekvenciarészlete, és így tovább. Néhány gyakran vizsgált inzulin elsődleges szerkezetében fellelhető különbség a IV. táblázatban látható: IV. táblázat Faj A-lánc B-lánc 4 8 9 10 3 29 30 Marha Glu Alá Ser Val Asn Lys Ala Birka GIu Alá Gly Val Asn Lys Ala Ló Glu Thr Gly lieu Asn Lys Ala Bálna Glu Alá Ser Thr Asn Lys Ala Sertés Glu Thr Ser lieu Asn Lys Ala Bálna spermium Glu Thr Ser lieu Asn Lys Ala Kutya Glu Thr Ser lieu Asn Lys Ala Ember Glu Thr Ser lieu Asn Lys Thr Nyúl Glu Thr Ser lieu Asn Lys Ser Patkány 1 Asp Thr Ser lieu Lys Lys Ser Patkány 2 Asp Thr Ser Heu Lys Met Ser A találmányban alább részletesen leírjuk a sertés in zulin átalakítását emberi inzulinná, azaz a B—30-ala nin treoninnal való helyettesítését. A találmány szerinti eljárás alkalmazható más inzulinok átalakítására is, például patkány inzulint emberi inzulinná vagy marha inzulint (B—30—THR)-marha inzulinná lehet alakítani. A sertés inzulin emberi inzulinná alakítása félszintetikus eljárással az inzulin-kémiában nagyon jelentős probléma volt. Az emberi inzulin csak egy aminosavval különbözik a sertés inzulintól, mégpedig a B-lánc C-terminális aminosavja az emberi inzulinban treonin, míg a sertés inzulinban alanin. Az alanin treoninra történő kicserélését kezdetben kémiai módszerrel végezték, újabban enzimatikus eljárást használnak erre a célra. Ruttenberg [Science 177, 623 (1972)] szerint a sertés inzulin emberi inzulinná alakítása kémiai módszerrel a következő lépésekből állt: észterezés inzulin-hexametil-észterré, tripszines hidrolízis dezoktapeptid-inzulin (rövidítve DOI)-pentametil-észterré, az aminocsoportok védése, kapcsolás a megfelelő, emberi inzulin szekvenciát tartalmazó szintetikus oktapeptiddel, amino-védőcsoportok savas hasítása, végül a metil-észter-csoportok lúgos elszappanosítása. Ázonban soha senki nem volt képes tiszta emberi inzulint előállítani ezzel a módszenei, mivel a kémiai reakciólépések és különösen az utolsó lépésben végrehajtott lúgos - elszappanosítás következtében az inzulin molekula komolyan károsodott, és az A-lánc C-terminális aminosavjában izoaszparagin is képződött [Gattner és munkatársai, Semisynthetic peptides and proteins, Eds. RE Offord and C-Di Bello, Acad. Press, New )'> York 1978. 181. oldal]. A káros hatások elkerülése céljából Obermeier és Geiger [Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem 357, 759 (1976)] az oktapeptid kapcsolását a DOI-oldallánc karboxilcsoportjainak védése nélkül hajtották végre. így alapos tisztítás után tiszta emberi 1 t* inzulint tudtak izolálni, de igen alacsony kitermeléssel. Gattner és munkatársai is próbálkoztak hasonló eljárással, különböző inzulin-fragmenseket alkalmazva. Azonban kémiai módszerekkel ezidáig még senkinek sem sikerült nyomnyi mennyiségnél több tiszta 70 emberi inzulint előállítani. Bodanszky, M. és munkatársai a 3276961. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertettek egy eljárást emberi inzulin előállítására, amely szerint az emberi inzulint más állati inzulinokból állították elő enzimatikus úton, karboxipeptidáz A és tripszin segítségével, treonin jelenlétében. Ezzel az eljárással nem valószínű, hogy emberi inzulint elő lehet állítani, mivel a tripszin és a karboxipeptidáz A nemcsak a lizil-alanin (B—29—B—30) peptidkötést hidrolizálja, hanem az inzulin egyéb helyein lévő kötéseket is, a fenti bejelentésben leírt körülmények között. A tripszin inkább az arginil-glicin (B22—B23) peptidkötést hidrolizálja, a lizil-arginin (B—29—B30) peptidkötés helyett. Emellett a karboxipeptidáz A nem tudja a B-lánc C-terminális végéről az alanint lehasítani az A-lánc C-terminális aszparaginjának lehasítása nélkül. A reakciót ammónium-hidrogén-karbonát pufferoldatban kell végrehajtani ahhoz, hogy az aszparagin lehasadását elkerüljük. Ezt a körülmény Schmitt 1978-ban fedezte fel [Schmitt: Hoppe- Seyler’s Z. Physiol. Chem. 359. 799 (1978)]. Továbbá peptid szintézis aligha mehet végbe, mivel ilyen körülmények között a hidrolízis sebessége nagyobb, mint a szintézis sebessége. Inouye és munkatársai [J. AM. Chem. Soc. 101, 751 (1979)] sertés inzulinból nyert, N-terminálison védett DOI-t az emberi inzulin B—23—B—30 szekvenciájának megfelelő oktapeptiddel kapcsolva tripszin katalizátor jelenlétében emberi inzulint állítottak elő. Azonban ez az eljárás nehézkes, mivel a sertés inzulint először tripszinnel emésztik, a kapott DOI-t N-terminálisán BOC—N,-dal (terc-butoxi-karbonil-azid) acilezve védik, majd az így kapott terméket 20 órán át inkubálják egy külön szintetizált olyan emberi B—23— —B—30 oktapeptiddel, amelyben a B—29 lizin BOC- csoporttal van védve. A kapott (BOC)3-emberi inzulinból ezután trifluor-ecetsav-anizol elegyben 0 °C-on 60 percen át tartó hidrolízissel eltávolítják a védőcsoportokat. A felhasznált (BOC)2-DOI-ra számított kitermelés 49% volt. A fentihez hasonló módon Morihara és munkatársai [Nature 280, 412 (1979)] karboxipeptidáz A-val 8 órán át emésztett sertés inzulinból származó (B—30- dezalanin)-inzulinból (DAI) szintetizáltak emberi inzulint. 10 mmól/1 DAI-t nagy feleslegben levő 0,5 3Û •lí. 2
