185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
1 185668 2 mól/1 treonin-terc-butil-észterrel [(Thr—Obu')] 37 °C-on 20 órán keresztül inkubáltak, nagy feleslegben lévő szerves társ-oldószer jelenlétében. A keletkezett (B—30-Thr—OBu')-inzulinból a védőcsoportot trifluor-ecetsawal távolították el anizol jelenlétében. A kitermelés 41% volt. Hasonló kísérletben (B—30— Thr)-marha inzulint állítottak elő 60%-os kitermeléssel. Azonban a fenti eljárás is nehézkes, mivel a kiindulási inzulint előzetesen kezelni kell, a kapcsolási idő hosszú és a védőcsoportokat is el kell távolítani. Nagy mennyiségben szerves társ-oldószereket is használni kell, hogy az enzim hidrolitikus aktivitását a lehető legkisebbre csökkentsék. Egy másik kísérletben Morihara és munkatársai [Biochem. Biophys. Res. Comm. 92, 396 (1980)] enzimatikus katalizátorként Achromobacter proteáz I-et használtak fel a DAI nagy feleslegben lévő Thr-terc-butil-észterrel történő kapcsolására, a kapott (B—30- Thr-OBu‘)-inzulint a fentiekhez hasonló módon izolálták, majd a védőcsoportot eltávolították. Noha nagy kitermelést értek el (52%), a reakcióidő hosszú, 20 óra volt. Egy hasonló kísérletben marha inzulinból kiindulva (B—30-Thr-Obu‘)-marha inzulint sikerült előállítani 58% kitermeléssel. Az előző két irodalmi utalásban leírt eljárások megtalálhatók az 1980. október 29-én közzétett EP 17938. számú európai szabadalmi bejelentésben és a dán 1556/80. számú szabadalmi bejelentésben is. Űjabban kimutatták, hogy a karboxipeptidáz Y enzim is hatékony katalizátor a peptid-szintézisben [Widmer és Johansen, Carlsberg Res. Comm. 44, 37 (1979) és a dán 1443/79. számú szabadalmi bejelentés, elsőbbsége 1979. április 6.]. Továbbá kimutatták azt is, hogy ez az enzim bizonyos körülmények között elősegíti egy peptidlánc C-terminális aminosavjának más aminosavra vagy aminosav-származékra történő cseréjét, transzpeptidációs reakcióban [PCT/DK 80/00020. számú, 1980. április 1-én bejelentett, 1980. október 16-án WO 80/02151 szám alatt közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés; EP 17485. számú, 1980. október 15-én közzétett európai szabadalmi bejelentés; és a fenti PCT/DK 80/00020. számú bejelentésen alapuló 136611. számú, 1980. április 2-i elsőbbségű és 220022. számú, 1980. december 2-i elsőbbségű amerikai egyesült állomokbeli szabadalmi bejelentések]. Az alapvető reakcióelvet a feltalálók, Breddam és munkatársai a Carlsberg Res. Comm. 45, 237 (1980) irodalmi helyen sokkal részletesebben kifejtették. Breddam és munkatársai fedezték fel a karboxipeptidáz Y eddig ismeretlen peptidil-aminosav-amid-hidroláz aktivitását. Noha az enzim-katalizálta transzpeptidációs reakciót a fenti nemzetközi és amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben leírták és példákkal alátámasztották, a reakció alkalmazhatóságát az inzulinnal kapcsolatban nem említették, sem példákkal nem illusztrálták. A találmány tárgya eljárás az inzulinok B—30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére. Az eljárás mentes a fentebb említett hasonló jellegű eljárások hátrányaitól, vagyis nem szükséges a kiindulási inzulint előkezelni, a reakcióidő nem hosszú és a védőcsoportokat nem kell kémiai úton eltávolítani. Még pontosabban a találmány tárgya egyedülálló és egyszerű eljárás a sertés inzulin nagy tisztaságú humán inzulinná alakítására, jó kitermeléssel. A találmány tárgya továbbá tökéletesített eljárás a B—30 aminosavon védett karboxilcsoportot tartalmazó inzulinok védőcsoportjának eltávolítására, különösen az amidszármazékok dezamidálására, tekintet nélkül az inzulin eredetére. Összefoglalóan a találmány tárgya eljárás inzulinok B—30 aminosavjának enzimatikus helyettesítésére, azzal jellemezve, hogy valamely Inz-X általános képletű inzulint — a képletben X jelentése egy B—30 aminosav — egy a) H—B—NH2 általános képletű aminosav-amiddal — a képletben B aminosav-maradékot jelent b) H-B-OR3 általános képletű aminosav-észterrel — a képletben B aminosav-maradékot jelent, R3 jelentése alkil-, cikloalkil-, aril-, heteroaril-vagy aralkilcsoport — reagáltatunk élesztőből izolált vagy állati, növényi vagy mikrobás eredetű L-specifikus szerin- vagy tiolkarboxipeptidáz enzim jelenlétében, körülbelül 7—10,5 .pH-értéken vizes oldatban vagy diszperzióban, majd a kapott Inz-B-NH2, Inz-B-B-NH2 vagy Inz-B-OR3 általános képletű inzulin-származékokról az -NHj, B-NH2 vagy -OR3 védőcsoportokat eltávolítjuk, A fenti védőcsoport lehasítási lépés természetesen nemcsak az előző transzpeptidációs lépésben előállított inzulin-származékokra korlátozódik, hanem alkalmazható bármely hasonló származékra, tekintet nélkül azok eredetére, különösen az EP 17938. számú szabadalmi leírás szerint előállított származékokra, amint az az 5. példában látható. A találmány azon a meglepő felismerésen alapul, hogy a fent említett karboxipeptidáz enzim képes a sertés inzulin humán inzulinná alakítására, a B—30- alanint egyetlen lépésben treoninra cserélve, anélkül, hogy az eljárás során köztiterméket kellene izolálni vagy a termékről védőcsoportot kellene eltávolítani. Adott esetben egy inzulin-amid köztitermék izolálható, és kívánt esetben dezamidálható, ugyanezt a karboxipeptidáz enzimet alkalmazva. Mint az alább részletesen kimutatjuk, az átalakításra legmegfelelőbb treonin-származék a treonin-amid. Az átalakítás végén az emberi inzulin mellett egy bizonyos mennyiségű kiindulási sertés inzulin is marad a reakcióelegyben, amit bonyolult elválasztani a terméktől, ugyanakkor a keletkező inzulin-amid közti termék előnyösen elválasztható az átalakulatlan sertés inzulint tartalmazó reakcióelegyből, majd ezt követően dezamidálható, előnyösen ugyanazzal a karboxipeptidáz Y enzimmel. A karboxipeptidáz Y enzim széles peptidáz-specificitásának következtében, amit az idézett irodalmi utalásokban és szabadalmakban alaposan és részletesen leírtak, a találmány szerinti eljárás nem korlátozódik a sertés inzulin kiindulási anyagra, hanem bármely egyéb inzulin, így a fentebb említett különböző fajokból izolált inzulinok is és más aminosavak is alkal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
