185652. lajstromszámú szabadalom • Eljárás riboflavin mikrobiológiai úton történő előállítására
185 652 A találmány tárgya eljárás riboflavin mikrobiológiai úton történő előállítására. A riboflavint (B2-vitamint) széles körűen alkalmazzák a mezőgazdaságban, a gyógyszer- és az élelmiszeriparban. A mezőgazdaságban főként állati takarmányadalékként használják fel. Ismert olyan eljárás riboflavin előállítására, amelynek során az Eremothecium ashbyi gombát szubmerz körülmények között tenyésztik. A 389132 és a 368 302 számú szovjet szerzői tanúsítványok szerint az E. ashbyi gomba 96 órán keresztül hidrolt (keményítő előállításánál keletkező hulladék, glükóztartalma mintegy 50%) és kukoricalekvárt tartalmazó szója-tápközegben történő tenyésztés során 2000 mg/1 mennyiségig terjedő mennyiségű riboflavint termel. Ismert, hogy a növényi olajban, zsírsavakban, glicerinben vagy lecitinben gazdag tápközegekben a gombatörzsek termelékenysége megnő. Az 1767 260 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint a 3%-nál nagyobb mennyiségű glükózt, linolsavat, vajsavat vagy glicerint, ammónium-glutamátot, vitaminokat tartalmazó tápközegben tenyésztett E. ashbyi kultúrák 3800 mg/1 riboflavint termelnek. A 2028 355 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint az E. ashbyi gombát olyan tápközegben tenyésztik, amely 1—5% glükózt, növényi olajat, 5% kollagént, 0,5—5% lecitint, kukoricalekvárt tartalmaz. Ilyen körülmények között 4500—5000 mg/1 riboflavin termelődik. Az E. ashbyi kultúrával mikrobiológiai úton történő riboflavin előállításának a legnagyobb előnye a nagy bioszintetikus aktivitás. Ezzel szemben a riboflavin termelésére képes gombatörzsek nemkívánt tulajdonságokkal rendelkeznek. Ilyenek a hosszú növekedési periódus, amely a fermentáció idejét megnöveli, valamint az idegen mikroflóra szennyeződésekkel szembeni érzékenység és a tápközeg összetételével kapcsolatos megszorítások, amely szerint sok drága és nehezen hozzáférhető komponens szükséges. Annak elkerülése céljából, hogy az E. ashbyi kultúrában ne keletkezzenek idegen mikroflórák, a fermentációs tápközegbe antibiotikumokat visznek be, ezek azonban lényegesen megnövelik a fermentáció költségeit. Az E. ashbyi gomba tenyésztésénél a fermentációs tápközegben alkalmazott komponensek, mint például a különböző zsírok, glicerin, zsírsavak, lecitin nehezen hozzáférhetőek és drágák. Másik ismert eljárás szerint (3 900368 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás) a riboflavint a Bacillus subtilis faj szubmerz körülmények közötti tenyésztésével állítják elő. Ebben az eljárásban a FERM—P 1657 és FERM—P 2292 számú B. subtilis indukált mutánsait, különösen a nagy mennyiségben jelen lévő purinnal és purinanalógokkal szemben ellenálló vagy a purinokkal szemben auxotróf mutánsokat alkalmazzák. Ezeket a mutánsokat 8% glükózt, ásványi savat, növekedést elősegítő komponensként élesztőkivonatot, peptont, glutaminsavat, RNS(ribonukleinsav)-preparátumot, purint vagy purinanalógokat tartalmazó tápközegben tenyésztik. A 44 órás fermentáció alatt 560 mg/1 riboflavin termelődik a tenyészfolyadékban. Ennek az eljárásnak az előnye a 5 baktériumok gyors növekedési sebessége és ezzel együtt a fermentációs idő csökkenése. Az eljárásban alkalmazott Bacillus subtilis mutánstörzsek aktivitása azonban alacsony. Az eljárás hátránya ezen kívül, hogy a tápközegben alkalmazott komponensek, mint ' 0 például az RNS-preparátumok, a purin, a purinanalógok nehezen hozzáférhetők és ennek következtében az eljárás ipari méretekben nehezen alkalmazható. Találmányunk célja olyan mikrobiológiai eljárás kifejlesztése riboflavin előállítására, amellyel a fer- 15 mentáció ideje lerövidíthető és ezzel költsége csökkenthető, anélkül, hogy a termék hozama csökkene. A találmány feladata a Bacillus subtilis fajba tartozó riboflavin termelésére alkalmas új törzs kifejlesztése, amelynek nagy a flavinogén-aktivitása. 20 A fentieknek megfelelően találmányunk tárgya eljárás riboflavin előállítására a B. subtilis fajba tartozó riboflavin termelésére alkalmas mikroorganizmusok levegő jelenlétében végzett szubmerz tenyésztésével olyan tápközegben, amely szén- és nitrogénforrá: - sokat, valamint a szükséges ásványi sókat tartalmazza. A találmány szerint riboflavint termelő mikroorganizmusként a B. subtilis WNIIGenetika—304, CMJM P—2116 szám alatt letétbehelyezett, vagy a WNIIGenetikai—304a, CMJM B—2117 szám alatt letétbehelyezett törzseit alkalmazzuk. Az említett törzseket 1980. július 22-én helyeztük letétbe a „WNIIGenetika” Intézet Ipari Mikroorganizmusok Központi Múzeumában. A törzsek nevében szereplő „WNIIGenetika” megjelölés az „Ipari Mikroorganizmusok Genetikájával és Szelekciójával Foglalkozó Össznemzeti Kutatóintézet” rövidítése. A „CMJM” megjelölés az „Ipari Mikroorganizmusok Központi Múzeumáénak rövidítése. Az említett termelő törzsek kiindulási tenyészetéül az ismert B. subtilis SHWG törzs szolgál, amelyből egymástól független mutánsokat kapunk, amelyekkel a riboflavin szintetizálható: rosR — roseflavinnal szembeni ellenállóképesség, ribc — a szabályozó génben végbemenő mutáció, AGR — 8-azaguaninnal szembeni ellenállóképesség. Ezt követően genetikai módszerekkel előállítjuk a rosR — ribc — AGR háromszoros mutánst, amelyet ezután nitrozo-guanidinnel, nitrozo-metil-karbamiddal kezelünk, ultraibolya sugárzással sugárzunk be, majd az aktív variánsokat 3G szelektáljuk. így kapjuk a két törzset. A WNIIGenetika—304 törzs prototróf, a WNIIGenetika—304a törzs auxotróf mikroorganizmus, növekedési szükségletük nincs meghatározva. Mindkét törzs oligo-spóraképző. A spórák száma a kiindulási 5 tenyészethez viszonyítva 3—4 nagyságrenddel alacsonyabb. A riboflavin termelésére képes WNIIGenetika—304 és WNIIGenetika—304a törzsek tenyésztési-morfológiai tulajdonságait a táblázat tartalmazza. 65 2
