185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 rokhoz kapcsolódnak, e termékeket mind terápiásán, mind pedig diagnosztikailag is alkalmazhatjuk, például radioaktív, proton befogó vagy más toxikus fizikai vagy kémiai szerrel történő összekapcsolás útján. Ezáltal a toxikus anyagokat a vegyületek specifikus jellegénél 5 fogva lokalizálhatjuk,- oly módon, hogy a termékek a tumorsejtekhez és nem a szomszédos normális sejtekhez kötődnek. Ezt a szelektivitást általában a legdöntőbb vagy legalábbis az egyik legfontosabb tényezőnek tartják a daganatok hatásos kémiai vagy fizikai kezelésének 10 elérésében és ezt a tényezőt mindeddig nem sikerült elérni. A TAG tehát szelektív kapcsolódik a tumorsejtekhez és ezért új gyógyszernek Ígérkezik. A rosszindulatú daganatos beteg szérumából — ahogy ez majd az alábbi példákból is kitűnik - a TAG egyik 15 típusa, a lassú TAG (S-TAG), [eltérően a másik TAG tipustól, a gyors TAG-tól (F-TAG)], viszonylag nagyobb mennyiségben nyerhető adott mennyiségű szérum térfogatból, mint a tumorban nem szenvedő betegek szérumából. Ez azt jelenti, hogy vagy egy természetesen elő- 20 forduló TAG-prekurzor (P-TAG) koncentrációja nőtt meg, vagy olyan más tényezők játszanak szerepet, amelyek az S-TAG in vitro képződését viszonylag jobban segítik elő, mint az F-TAG-ét. A szintetikus „cél” termékek és a TAG prekurzoraik- 25 tói való függése, valamint a feltételezett, de ki nem mutatott sejtben lévő „antigének” és cirkuláló „antitestjeik” in vivo egymástól való függése között lehetséges kapcsolat, de ez eddig még nem tisztázott. így például az antitestekhez hasonlóan az F-TAG és az S-TAG astrocytin- 30 nel egyedülálló, határozott reakciósávokat képez az Ouchterlony-gél diffúzióban és a „cél” nyutakba történő beoltása fokozza a nyúlszérumban a TAG-termékek hozamát, miután a nyúlszérum a „cél”-lal reagált. Az a felismerés, hogy a prekurzornak lehet egy normális 35 szintje, amely hasonlít egy sejt antigén cirkuláló antitestéhez, amely egy nem-osztódó sejtben rejtve van, felveti egy reakciópár lehetséges működésének kérdését. Véleményünk szerint a TAG-prekurzor ! (P-TAG) és a ,,cél”-szerű vegyületek in vivo léteznek és sejtbuiján- 40 zást, valamint sejthalált szabályzó működést fejtenek ki. így például egy sejt alkotórész előtérbe kerülése, amely normális esetben nincs közvetlenül alávetve a szérum proteineknek, sejtosztódás közben történhet. Ez azt eredményezheti, hogy ez a sejt alkotórész „cél”- 45 szerű vegyületté alakul, amelyhez a szérumból származó P-TAG-szerű molekula kapcsolódhat és ez a sejtosztódást fokozza vagy gátolja. Egy sérült vagy rosszul működő, nem-osztódó sejt pedig működésbe helyezhet egy „cél”-szerű anyagot és ha ehhez P-TAG-szerű molekulák 50 kapcsolódnak, akkor ez gyógyító hatású lehet. Bizonyos sejtkörülmények mellett azonban a P-TAG molekulák kapcsolódása sejtroncsolást idézhet elő (például a fent leírt módon szintetizált anti-GLIOMA-TAG kifejezetten citotoxikus a szövettenyészetben tenyésztett glioma 55 tumorsejtekre). Ez a mechanizmus a szervezet élete során képet ad a sejtosztódás szabályzásának normális mechanizmusáról vagy az egyes sejtek helyreállításáról vagy eltávolításáról a testben a szervezet élete során. A sejt alkotórészek előtérbe lépésének abnormális meg- 60 növekedése esetén, amikor abnormálisán nagy mennyiségű „cél”-szerű anyagok képződnek, amely gyorsan osztódó ráksejtek, például agygliomák esetén fordul elő, akkor az egyik szérum P-TAG koncentrációjának megnövekedése idézhető elő a másikhoz viszonyítva. 55 A prekurzorok valódi funkciójától függetlenül az alábbi példákban leírt szérum diagnosztikai teszt alapja a TAG egyik típusa, az S-TAG viszonylagos mennyiségének a növekedése. Az S-TAG előállítására a rosszindulatú daganatos betegek szérumából in vitro módszerrel történik. 1. példa Nyers astrocytin-prekurzort tartalmazó frakció előállítása. Sebészeti úton eltávolított emberi agyglioma tumorszövetet a lehető legjobban megszabadítjuk a felületi véredényektől és a normális agyszövettől. 11 g így kipreparált daganat szövet hat 1,5 g-os és két 1,0 g-os aliquot-résszé mérünk szét. Az egyes aliquotokat ezután az alábbi módon kezeljük. Az egyes aliquotokat semleges puffer oldattal ultraszonikus vagy más mechanikai módon homogenizáljuk. Az aliquotokat például pH = 7 értékű, 1 g szövetre eső 100 cm3 0,005 mólos foszfát puffer-oldatban homogenizáljuk egy keverőben. A homogenizálást hidegen 4 °C-on kell végezni, hogy a proteinek denaturálódását megakadályozzuk. A keverőt például 0-5 °C-os helységben elő kell hűteni és csak három percig kell működtetni. A homogén terméket ezután egy hűtött ultracentrifugában 30 percig centrifugáljuk 80 000 g gyorsulással tisztítás céljából. A felülúszót dekantáljuk és hűvösön (4 aC-on) tartjuk. Az oldhatatlan maradékot további 100 cm3 semleges pufferrel ismét homogenizáljuk és az előbbi módon centrifugáljuk és a második felülúszót az elsővel összeöntjük. A legjobb termelést akkor érjük el, ha a homogenizálás és centrifugálás műveleteit addig ismételjük, amíg a felülúszóban egy milliliter oldatban 50 mikrogrammnál kevesebb protein nem lesz. A legtöbb szövet esetében ezt az ötödik extrahálásnál érjük el. Az így kapott oldatokat egyesítjük és bepárlással töményítjük, majd dializáljuk. A dializálást 0,006 mólos, közel semleges (pH = 7,2) foszfát pufferrel szemben végezzük 4 °C-on és így 15 ml oldatot kapunk. Ennek az oldatnak a térfogatát feljegyezzük és a teljes protein analízishez egy kis mintát veszünk és a maradékot frakcionáljuk és így 1-4 pK értékű protein frakciót kapunk. A frakcionálási előnyösen kromatografálással végezzük: \z oldatot 4 °C-os hideg szobában DEAE cellulóz (CELLEX-D) 2,5X11,0 cm méretű, 0,005 mólos nátrium-foszfát pufferrel egyénsúlyozott oszlopon frakció náljuk. A lépésenként végzett eluálást az alábbi oldatokkal végezzük: 1. oldat: 4,04 g nátrium-dihidro-foszfát és 6,50 g dinátrium-hidrofoszfát 15 liter desztillált vízzel készített 0,005 mólos oldata, pH = 7; 2. oldat: 8,57 g nátrium-dihidro-foszfát 2480 mi desztillált vízzel készített oldata; 3. oldat: 17,1 g nátrium-dihidro-foszfát 2480 ml desztillált vízzel készített 0,05 mólos oldata, pH = 4,7; 4. oldat: 59,65 g nátrium-dihidro-foszfát 2470 ml desztillált vízzel készített 0,175 mólos oldata; 5. oldat: 101,6 g nátrium-dihidro-foszfát 2455 ml desztillált vízzel készített 0,3 mólos oldata, pH = 4,3; 6. oldat: 340,1 g nátrium-dihidrogén-foszfát 2465 ml desztillált vízzel készített 1,0 mólos oldata, pH = 4,1; 7. oldat: 283,64 g 80%-os foszforsav 2460 ml desztillált vízzel készített 1,0 mólos oldata, pH = 1. 5
