185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 6—10 ml, korábban leírt módon készített idegszövet kivonatot adunk az oszlopra. A kivonatot keresztül engedjük az oszlopon. Ezután az 1. oldattal fedjük és 300 ml 1. oldatot tartalmazó tartályt helyezünk az oszlopra, hogy az oldat súlyánál fogva csepegjen az oszlopra. Automatikus frakciószedővel 3 ml-es aliquotokat gyűjtünk össze a lefolyó folyadékból. Az egymás után következő eluáló oldatokat lépésenként cseréljük a következő eluáló cső számoknál. 1. oldat cseréje: 88-as csőnél, az 1. oldatot az oszlopon a gyanta tetejéig engedjük le, majd lefedjük 2. oldattal és 50 ml 2. oldatot tartalmazó tartályt szerelünk fel; 2. oldat cseréje: 98-as csőnél, a 2. oldatot az oszlopon a gyanta tetejéig engedjük le, majd lefedjük 3. oldattal és egy 75 ml 3. oldatot tartalmazó tartályt szerelünk fel; 3. oldat cseréje: 114-es csőnél, a 3. oldatot az oszlopon a gyanta tetejéig engedjük le, lefedjük 4. oldattal, majd 150 ml 4. oldatot tartalmazó tartályt szerelünk fel; 4. oldatot cseréje: 155-ös csőnél, a 4. oldatot az oszlopon a gyanta tetejéig engedjük le, lefedjük 5. oldattal és egy 125 ml-es, 5. oldatot tartalmazó tartályt helyezünk fel az oszlopra; 5. oldat cseréje: 187-es csőnél, az 5. oldatot az oszlopon a gyanta tetejére visszük fel, lefedjük 6. oldattal, majd 175 ml 6. oldatot tartalmazó tartályt szerelünk fel; és 6. oldat cseréje: 212-es csőnél a 6. oldatot az oszlopon a gyanta tetejére visszük fel, lefedjük a 7. oldattal, majd 125 ml 7. oldatot tartalmazó tartályt szerelünk fel, és az eluálást addig folytatjuk, amíg a 260-as csőnél az eluálás be nem fejeződik. Minden új adag szövetkivonathoz frissen előállított gyantát kell használni. Minden kifolyó csövet kvatitatív analizálunk, meghatározzuk a fehérje tartalmat. A 212— 230 csövekben található eluáturnokat összeöntjük és a bennük lévő nyers termékekből kapjuk az asírocytint, Bár a nyersanyagot már korábban leírták (10B néven ismert frakció Protein Metabolism of the Nervous System, 55-69. o. Pleum Press, 1970, Journal of Neurosurgery, 33. kötet, 281-286. o. 1970, szeptember) a 10B frakcióból lehasított új terméket, az astrocytint most állítottuk elő. A nyers 10B frakciót 0,1-10 mg mennyiségben állíthatjuk elő arra az eredeti friss idegrendszer szövet 1 g-jára vonatkozatva, amelyből nyerjük. Az astrocytin-prekuzoron kívül különböző mennyiségű kovalensen kötött szénhidrát maradékokat tartalmaz, például hexózokat, nevezetesen glükózt, galaktózt, mannózt; hexózaminokat, például glükózamint, galaktózamint, mannózamint és esetenként más cukrokat, például fruktózt, ribózt és esetleg ramnózt. Nagy molekulasúlyú protein termékeket, számos lipidet és nukleinsavakat is tartalmaz. 2 példa Tisztított astrocytin termelése nyers astrocytin-prekurzort tartalmazó frakcióból: Az astrocytin-prekurzort tartalmazó frakciót a szenynyeződések eltávolítására további tisztításnak vetjük alá. Az előnyös foganatosítási módoknál az 1. példa szerinti mintát Sephadex G-50 gyantán kromatografáljuk. Az oszlop méretei: 40 cm hossz, 2,5 cm átmérő, 196 ml térfogat. Az alkalmazott nyomás 40 Hgmm, az áramlási sebesség 35 ml/óra, a puffer 0,05 mólos foszfát puffer oldat, pH = 7,2. Az első (átfolyó) csúcs az astrocytin- 6 prekurzort a szennyeződésekkel együtt tartalmazza és a további csúcsok csak szennyeződéseket tartalmaznak. A fent említett első átfolyó csúcsban lévő termékeket Sephadex G-15 oszlopon koncentráljuk, (a gyanta proteinek áramlását lassítja), majd Cellex-D oszlopon keresztül engedjük az 1. példában leírt 1-6 oldatokkal és azonos eluálási lépéseket alkalmazunk, mint az 1. példában. Az astrocytin éles csúcsként jelentkezik ugyanazokban a csövekben (212-230), mint az 1. példánál és így a Ceílex-D oszlopon végzett kromatográfia során ugyanúgy viselkedik, de a nagyszámú szennyeződés nincs jelen. A kis molekulasúlyú szennyeződéseket az irodalomból ismert módon távolíthatjuk el, például millipórusú lemez szűréssel. Ez a módszer abból áll, hogy az astrocytint szűréssel megszabadítjuk a sóktól és más kis molekulasúlyú szennyeződésektől, a szűrést Millipore Pellicon lemezen (1000, 13 mm) keresztül végezve, ez a szűrő az 1000-nél nagyobb molekulasúlyú anyagokat' fenntartja és az ennél kisebb molekulasúlyú anyagokat átengedi. Az astrocytin nevű termék a Pellicon lemezen marad és az 1. példában leírt 1. oldattal mosva nyerjük ki. A mintegy 8000 molekulasúlyú astrocytint ezután izoláljuk az oldatból. Előnyösen vékonyréteg-kromatografálással végezzük az izolálást. A kereskedelemben kapható készüléket a Boehringer Mannheim GmbH Pharmacia Fine Chemicals and CAMAG (Svájc) cég gyártja. A szuperfinom Sephadex G-200 (2,5 g) gyantát 85 ml 0,5 mólos nátrium-klorid 0,02 mólos Na^HPC^-KHiPQi foszfát pufferes oldatában állítjuk elő (pH = 6,8/6,6— 7,0). Az elegyet két vagy három napig hagyjuk duzzadni és közben néhányszor mérsékelten megkeverjük. (Mágneses vagy más keverők használata nem ajánlatos.) A megduzzadt gélt három hétig stabilizáljuk, azonban a megduzzadt gélen baktérium- vagy gombatenyészetek szaporodhatnak el. Így, ha a gélt hosszabb ideig akarjuk tárolni, akkor kis mennyiségű bakteriosztatikus szert kell hozzáadni (nátriumazid, 0,02%). 2,5 g száraz gélt használunk fel két 20X20 cm-es üveglemezen 0,50 mm vastag rétegek készítésére. A lemezeket szobahőmérsékleten 10 percig hagyjuk száradni és nedves kamrába helyezzük, ahol két hétig tároljuk vagy azonnal felhasználjuk megfelelő lelő-egyensúlyozás után. (Általában az éjszaka folyamán legalább 12 óráig.) Az egyensúlyozás fő szerepe az álló és mozgó fázisú térfogatok közötti arány normalizálása. A vízszintes helyzetben lévő, előre kiegyensúlyozott üveglemezekre mikropipettával visszük fel a meghatározandó anyagokat foltok vágy csikók formájában a kiindulási vonalnál. 10-20 p 0,2-2 %-os protein-oldatot helyezünk a 18X18 mm-es mikroszkóp fedőlemez élére és a gél felületére helyezzük. Pár másodperc múlva az oldat felszívódik a gélbe. Valamennyi mintát először a fedőlemezeken készítjük el, majd gyorsan felhasználjuk. Ha nem elég anyagot használunk, akkor nehéz az elválasztás után egyes foltokat lokalizálni. Ha túl sok anyagot alkalmazunk, akkor nincs határozott szétválás. Könnyebb kezelés végett a mintákat pufferrel hígítjuk és a mintákat 22 -os szögben tartott üveglemezzel leszálló kromatográfiás technikával választjuk el. 1-2 cm/óra áramlási sebesség a megfelelő. Jelzőanyagokat például citokróm C-t, hemoglobint, mioglobint vagy brómfenol kékkel jelzett albumint használunk a lemez különböző helyzeteiben és ezeket használjuk referencia proteinként is az ismeretlen anyagok relatív távolságának (mozgékonyság) kiszámítására. A min5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
