185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 A jelen találmány tárgya eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására a 2 606 275 sz. és a 2 546 670 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratokban leírt recogninok segítésével radioaktív jelzéssel. A recognineket úgy állítjuk elő, hogy abnormális sejteket vagy szöveteket, például tumor-sejteket vagy mesterséges rákos sejteket kezelünk, majd a kivált termékeket szétválasztjuk. A recogninok „kemoreciprokaik” előállítására használhatók, azaz a recogninokat vagy hordozón lévő recogninokat testfolyadékokkal hozzuk érintkezésbe. Ezeket a kemoreciprokokat diagnosztikai és terápiás célokra, például rák kimutatására és kezelésére használhatjuk. A kemoreciprokok olyan anyagok, amelyek immun-kémiai specifikussággal reagálnak in vivo vagy in vitro a recogninnal, például egy kvantitatív precipitációs tesztben, Outerchlony-féle kettős immun diffúzióban vagy immunfluoreszcenciában. A recogninok egyike az astrocytin. Az astrocytint agy tumor szövetből, előnyösen agy-glioma tumor szövetből állítjuk elő. Először az astrocytint tartalmazó prekurzort tartalmazó protein frakciókat extTaháljuk a szövetből. Az extrahálást előnyösen úgy végezzük, hogy a szövetet homogenizálási körülmények között semleges pufferrel kezeljük vagy olyan technológiát alkalmazunk, hogy a sejteket és szöveteket szétroncsoljuk és így az astrocytin-prekurzort tartalmazó protein frakciókat oldhatóvá tesszük. Ebben az állapotban az astrocytin-prekurzor még sok nagy molekulasúlyú anyaghoz kötődik, beleértve a proteineket, glükoproteineket, lipoproteineket, nukleinsavakat, nukleoproteineket stb. Az oldatba vitt proteineket ezután kiválasztjuk a kapott szövetkivonatból. A szövetekből kapott kivonat-oldatot tisztítjuk, hogy az oldhatatlan részecskéket eltávolítsuk. Az alacsony molekulasúlyú szennyeződéseket ezután párologtatásos koncentrálási technikával eltávolítjuk a kapott oldatból. A kapott oldatot ezután úgy kezeljük, hogy az astrocytinprekurzort lehasítjuk a többi szennyeződésről és így 1-4 pK értékű protein frakciót kapunk. így például az oldatot kromatográfiás oszlopra visszük és egyre savasabb oldószerekkel eluáljuk. A semleges és savas frakciókat egészen pK = 4 tartományig eltávolítjuk és a pK = l-4 értékű frakciókat összegyűjtjük. Az eluátumot ezután olyan kezelésnek vetjük alá, hogy 8000 körüli molekulasúlyú terméket kapjunk. Ezt úgy érjük el, hogy először az alacsony molekulasúlyú (például 1000 molekulasúly alatti) anyag eltávolítására szüljük le az anyagot, majd újabb szűréssel eltávolítjuk a 25 000-en felüli molekulasúlyú anyagokat. Az 1000-25 000 közötti molekulasúlyú anyagokat tartalmazó frakciót tovább kezeljük, például vékonyrétegkromatografáljuk is így astrocytint kapunk. Az astrocytin előállítása tehát úgy történik, hogy agyglioma tumor szövetet semleges pufferrel kezelünk, ismételten homogenizálunk, nagy sebességgel centrifugálunk, a kapott 1-4 pK értékű frakciót különválasztjuk a kapott extraktumtól, ebből a frakcióból kiválasztjuk a nagy molekulasúlyú anyagot, azaz 230 000-ig és ebből izoláljuk a 8000 molekulasúlyú astrocytint. A fenti módon előállított astrocytint az jellemzi, hogy egysávos csapadékot képez specifikus antitestjével kvantitatív precipitációs tesztekben, Ouchterlony-gél diffúziós tesztekben, vízben és savas vagy semleges vizes oldatokban oldódik, lúgos pH mellett oldhatatlan, abszorpciós színképében a csúcs 280 mju-nél jelentkezik és molekulasúlya 8000 körül van. Az astrocytint jellemzi továbbá a magas glutaminsav és aszparaginsav-tartalom és ezeknek a savaknak igen magas aránya a hisztidinhez viszonyítva. Az astrocytin további analízise az alábbiakban következik. A fent leírt módszerhez hasonló módon egy másik recognint is előállítunk, melynek neve „malignin” és előállítása mesterséges, in vitro fermentációval tenyésztett ráksejtekből történik. A malignin molekulasúlya. 10 000 körüli és az aminosav összetétele hasonló, de • azért eltér az astrocytinétől, azaz magas glutaminsav és aszparaginsav-tartalom és ezeknek a savaknak a hisztidinhez viszonyított magas aránya jellemzi. A malignin részletesebb analízise a továbbiakban következik. A malignin előállítása úgy történik, hogy a fermentációs kultúrában tenyésztett mesterséges ráksejteket semleges pufferrel extraháljuk ismételt homogenizálással és nagysebességű centrifugálással, a kapott extraktumból a pK = l-4 tartományban lévő frakciót izoláljuk és ebből a frakcióból kiválasztjuk a nagy molekulasúlyú (230 000-ig) anyagokat és ezekből izoláljuk a 10 000 molekulasúlyú terméket. A mesterséges sejtfermentációval kapott malignin mennyiségét és a mesterséges sejtfermentációban kapott összfehérjében a malignin százalékát nagyméretű tenyésztő tartályok alkalmazásával növelhetjük. A fent leírt módon előállított malignint az jellemzi, hogy egysávos csapadékot képez specifikus antitestjével kvantitatív precipitációs tesztekben és Ouchterlony-gél diffúziós tesztekben, vízben és savas vagy semleges vizes oldatokban oldódik, lúgos pH-n nem'oldódik és abszorpciós színképe 280 m/i hullámhossznál mutat csúcsot és molekulasúlya 10 000 körül van. A recogninokat az jellemzi tovább, hogy brómacetücetlulózzal brómacetil-cellulóz-recognin komplexet tudnak képezni és emlősökbe történő beoltás hatására specifikus anti-recognin antitesteket termelnek, melyek in situ specifikusan kapcsolódnak a recognin-prekurzorhoz. így képződik például az egyik anti-recognin, az antimalignin, amely in vitro toxikus az agytumor sejtekre. A recogninok, például az astrocytin és a malignin és hasonló anyagok hasznos termékek, amelyeket biológiai rendszerekbe be lehet vezetni, ezáltal csökkenteni lehet az idegen anyagokkal való reakciókat, például az anyagot recogninnal vonhatjuk be. További példa képpen megemlíthető a recognin bevezetése egy biológiai rendszerbe kemoreciprokok előállítása céljából. Tápanyagként is adagolható bizonyos biológiai rendszer növekedésének serkentésére, mely rendszernek részét képezi. A recognin további alkalmazási területe a „cél” reagensek előállítása, ennek során recognin komplexeket hordozóra viszünk fel, hogy megkönnyítsük alkalmazhatóságát a biológiai rendszerekben. így a komplex a recognin fizikai-kémiai tulajdonságait hordozza. A hordozókat olyan anyagok közül választjuk, melyek a recogninnal komplexet képeznek és melyek gyakorlatilag biológiailag inersek. Az irodalomból ismert bármely olyan anyag, amely a polipeptidekkel vagy proteinekkel stabil komplexet képez, alkalmas recogninnal történő komplex képzésre. Például ilyen anyag lehet egy cellulóz-alapú anyag, például a brómacetil-ceílulóz. Azonkívül, hogy a hordozónak biológiailag inersnek kell lennie, a hordozónak nem 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
