185535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin-származékok előállítására

1

2

185 535

maradékot éterrel eldolgozzuk. A szilárd anyagot szűrjük. éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. A nyers termék súlya: 5,50 g; termelés: 84,6%.

A fenti védett tripeptid-etil-amidból 5,36 g-ot 30 ml etil-acetátban enyhe melegítéssel feloldunk. Aktív szén- g nel derítjük, kétszer 10 ml etil-acetáttal átmossuk. A szűrlethez részletekben 75 ml deitil-étert adunk. A kiváló olajos anyag nagyon gyorsan megszilárdul. Mintegy 2 óra állás után szűrjük, etil-acetát és éter (2:3) eleggyel, majd éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. A szinte- ^ q len, sziláid védett tripeptid-etil-amid súlya: 4,70 g. (74,3%).

Op. 116—118 °C

[a]20 = 57,0° (c=l; MeOH)

R2 = 0,74; R* = 0,49

c) H-Leu-Arg(N02)-Pro-NHET • HBr 15

Molekulasúly = 537,4

1,18 g (2 mmol) Z-Leu-ARg(N02)-Pro-NHEt tripeptidet oldunk 10 ml jégecetes hidrogén-bromid oldatban, majd 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. 100 ml víz- 20 mentes éterrel elporítjuk, szűrjük, majd a gyengén sátga, porszerű anyagot exszikkátorban szárítjuk. Halványsárga higroszkópos anyagot kapunk, melynek súlya: 1,30 g.

R2 = 0,14

25

d) BOC-D-Phe-Leu-Arg(N02)-pro-NHEt Molekulasúly = 703,8

1,07 g (2 mmol) H-Leu-Arg(N02)-Pro NHEt • HBr tripeptid sót oldunk 5 ml dimetil-formamidban, 0 °C-ra hűtjük, és 0,28 ml (2 mmol) trietil-amint és 1,02 g (2 mmol) 30 BOC-D-Phe-OPCP 5 ml dimetil-formamidos oldatát adjuk hozzá. Az oldat pH-ját ezután trietilaminnal (TEA) 7 és 8 közé állítjuk, az oldatot hagyjuk felmelegedni, majd 20 °C-on 48 órán át keverjük, miközben pH-ját TEA-val semlegesen tartjuk. 35

A dimetilformamidot vákuumban eltávolítjuk, a maradékot 70 ml kloroformban oldjuk, és tízszer 10 ml 0,1 mólos ammónia oldattal mossuk. A kloroformos oldatot bepárolva az anyag éterrel elporítható.

Termelés: 1,1 g (78%) 40

R2 = 0,6; F* = 0,1

e) BOC-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NHEt Molekulasúly = 658,8

1,1 g (2 mmol) BOC-D-Phe-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt 45 tetra-peptidet oldunk 50 ml 50%-os ecetsavban, és 400 mg 10%-os palládiumos csontszén katalizátor jelenlétében hidrogénezzük 4 órán keresztül. A katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 50

A kapott nyers terméket 1,5x60 cm szilikagél oszlopon etil-acetát—piridin—ecetsav—víz 120:20:6:11 oldószerelegyben kromatografaljuk.

Termelés: 1,06 g (80,5%)

[a]22 = 36,5° (c—1, MeOH) 55

R2 = 0,9; R? = 0,1; R? = 0,6

f) H-D-PHe-Leu-Arg-Pro-NHEt • (TFA)2 Molekulasúly = 786,7

1,3 g (2 mmol) BOC-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NHt tetra- 60 peptidet oldunk 10 ml trifluor-ecetsavban (TFA) majd szobahőn 20 percig keverjük. A TFA-t vákuumban gyorsan eltávolítjuk, majd a maradékot éterrel elporítjuk és szárítjuk.

Termelés: 1,45 g (92%)

R? = 0,6; R; = 0,9; R9 = 0,3

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NHEt •

* CH3COOH Molekulasúly = 1303,4

286 mg (0,4 mmol) az 1. példa g) lépésében előállított Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 pentapeptidet oldunk 10 ml dimetilformamidban, —10 °C-ra hűtjük, és keverés közben 0,27 ml 6 n sósavat, majd 30,2 mg NaN02 tömény vizes oldatát csepegtetjük hozzá. 5 perc elteltével hozzáadjuk 314 mg (0,4 mmol) H-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NHEt * •TFA2 tetrapeptid 1 ml dimetilformamidban 0,27 ml trietilamin jelenlétében készült —10 °C-os oldatát. A reakcióelegyet szükség esetén TEA-val semlegesre állítjuk, 1 órán át —5 °C-on, 1 órán át 0 °C-on keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni.

A dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk, a maradékot Sephadex G-25 oszlopon (2x95 cm) 0,2 n ecetsav oldatban kromatografaljuk. A megfelelő frakciókat öszszegyűjtjük és liofilizáljuk.

Termelés 282 mg (54,1%)

[a]22 = -33,2° (c=l víz)

Rf = 0,3; Rf9 = 0,3; Rf12 = 0,7

Aminosav analízis: Glu 0,98; His 0,97; Ser 0,94;

Tyr 1,02; Phe 1,01; Leu 1,00;

Pro 0,94; Gly 0,99.

4 példa

Injekció elkészítése intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás beadás céljára:

a) Az (I) általános képletű gonadoliberin származékot 1—10 mg/ml töménységben desztillált vízben, fiziológiás sóoldatban vagy pufferolt vizes oldatban oldjuk. Az oldatot sterilre szűrjük, majd 50—500 pg anyagot tartalmazó térfogatokat ampullákba töltünk és liofilizáljuk, végül lezárjuk. Az ampullák anyagtartalmát kezelés előtt 1—10 ml desztillált víz hozzáadásával frissen oldjuk, és szükséges dózisnak megfelelő térfogatot injektáljuk.

b) Az (I) általános képletű gonadoliberin származékot 20—500 pg/rxú töménységben 0,9% NaCl-ot 0,9% benzilalkoholt tartalmazó vizes oldatban oldjuk. Az oldatot sterilre szűrjük, majd 50—500 pg anyagot tartalmazó térfogatokat ampullákba töltünk, és az ampullákat lezáijuk. Az így nyert oldatok közvetlen injektálásra alkalmasak.

5. példa

D-Thx6-Gonadoliberin-(l-9)-etilamid előállítása

a) BOC-D-Thx-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt Molekulasúly = 1315,5

0.650 g (1.21 mmol) H-Leu-Arg(N02-Pro-NHEt • HBr trípeptid származékot (3. példa, c pont) és 1080 g (1,23 mmol) BOC-D-Thx-OH 10 ml dimetilförmamidos oldatát és 0 °C-ra hűtjük. Ezután 0,252 ml (1,8 mmol) tríetilamint adunk az oldathoz keverés közben, majd 0,945 g (1,24 mmol) F-komplexet (diciklohexilkarbodiimid és pentafluor-fenol 1:3 arányú komplex vegyülete) adjunk hozzá. Két órán át 0 °C-on keveijük, majd 0,050 ml trietilamint adunk még a reakcióelegyhez és ezután egy éjjelen át szobahőmérsékleten keveijük. Másnap reggel még 0,24 g (0,32 mmol) F-komplexet adunk hozzá és még 5 órán keresztül keveijük. Ezután szárazra pároljuk a reakcióelegyet, 25 ml etilacetát és 10 ml víz elegyében felveszszük, az etilacetátos fázist 10 ml 1 n KHSO4 oldattal,

6