185535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin-származékok előállítására
1 185 535 konyréteg-kromatográfiával követjük az eluciót, és az nyagot tartalmazó frakciókat liofilizáljuk. A liofilizálást híg ecetsavból megismételjük. Termelés: 33 mg (50%) RJ = 0,5; Rf = 0,55; Rf100 = 0,10; R,12 = 0,66; Aminosav analízis: Glp 0,155;, His 0,140; Ser 0,148; Tyr 0,105; Leu 0,200; Arg 0,135; Gly 0,170; Pro nem számolható 2. példa D-Thx6-gonadoliberin előállítása a) BOC-D-Thx-Leu-Arg-Pro-Gly-NHi Molekulasúly = 1300,5 87,7 mg (30,1 mmol) BOC-D-Thx-t oldunk 1 ml dimetil-fbrmamidban, hozzáadunk 50 mg (0,11 mmol) Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 • HF-t és 15 pl (0,11 mmol) trietil-amint, a rekacióelegyet 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzácsepegtetjük 84,5 mg (0,11 mmol) F-komplex [C6HnNH-C=N-C6H,,* 2PFPOH] dimetil-formamidos I OPFP oldatát. Egy órán át 0 °C-on keverjük, éjszakára szobahőmérsékleten tovább kevertetjük. Másnap vákuumban bepároljuk, etil-acetáttal elporítjuk, szűrjük, és szilikagél oszlopon (1 cm x 15 cm) kromatografáljuk. Az oszlopot 120:6:11:20 etilacetát-piridin-ecetsav-víz oldószereleggyel ekvilibráljuk, és az anyagot is ezzel az eleggyel eluáljuk. 15 percenként kb. 2 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az eluciót vékonyréteg-kromatográfiával követjük, az azonos Rrü frakciókat összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk, éterrel elporítjuk, szűrjük és szárítjuk. Termelés: 32 mg Op. 208 °C (bomlik) [a]p = -6,8 (c=0,5, DMF) Rf = 0,35; R® = 0,7; Rf = 0,6 b) H-D-Thx • Leu-Arg-Pro-Gly-NHj • HCl Molekulasúly = 1236,9 50 mg az a) lépés szerint előállított védett pentapeptidet 5 ml jégecetben oldunk, és hozzáadunk 1 ml 1 n sósavas jégecetet. Szobahőmérsékleten keverjük. 4 óra múlva a reakció teljes. Az anyagot éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, és exszikkátorban szemcsés NaOH felett szárítjuk. Termelés: 40 mg (90%) Rf = 0,16; Rf = 0,67 c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thx-Leu-Arg-Pro-Gly-NH1 Molekulasúly = 1860,2 28,7mg (0,04 mmol) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 pentapeptid-hidrazidot oldunk 1 ml dimetil-formamidban, az oldatot —10 °C-ra hűtjük, és keverés közben 27 gl 6 n sósavat adunk hozzá. Az elegy hőmérsékletét továbbra is —10 °C-on tartva keverés közben 3 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát adjuk hozzá, majd még további 10 percig keverjük —5 és —10 °C között. Ezután 49,5 mg (0,044 mmol) a b) lépésben előállított H-D-Thx-Leu-Arg-Pro-Gly-NHí • HCl 1 ml dimetil-formamidban készült és lehűtött oldatát adjuk a fentebb elkészített azid oldatához, majd a reakcióelegy pH-ját trietil-aminnal 7—8-ra állítjuk. Egy órán át —5 és —10 °C közötti hőmérsékleten, majd 1 órán át 0 °C-on keverjük, és éjszakán át jégszekrényben állni hagyjuk. Másnap vákuumban bepároljuk. A visszamaradt nyers dekapeptidet Sephadex G-25 oszlopon (3 x 100 cm) megoszlási kromatográfiával butanol:propanol:ecetsav:víz (15:1:4:20) elegyben tisztítjuk. 5 ml-es frakciókat gyűjtve UV abszorpcióval, illetve vékonyréteg-kromatográfiával követjük az eluciót, és az 5 anyagot tartalmazó frakciókat liofilizáljuk. A liofilizálást híg ecetsavból megismételjük. Termelés 18,7 mg (25%) Rf = 0,65; Rf = 0,68; Rfn = 0,30; Rf12 = 0,81 3. példa D-Phe6-gonadoliberin-(l-9) -etilamid előállítása í a) Z-Arg (NOi)-Pro NHEt Molekulasúly = 465,47 3,242 g prolin-etil-amidot (22,8 mmol) feloldunk 70 ml tetrahidro-furánban. Az oldathoz adunk 7,33 g Z-Arg (N02)-OH-t (20,7 mmol) és 1,034 g N-hidroxi-benztriazolt. A reakcióelegyet jeges vízfürdőben hűtjük, és keverés közben 5,34 g diciklohexil-karbodiimid (25,9 mmol) 50 ml tetrahidro-furánban készült oldatát adagoljuk hozzá. A rekacióelegyet jéghűtés mellett 5 órán át, majd további 20 órán át szobahőmérsékleten keverjük, ezután szűrjük és tetrahidro-furánnal (THF) mossuk. A szűrletet vákuumban bepároljuk. A maradékot kloroformban feloldjuk. A kloroformos oldatot háromszor 35 ml 1:5 arányú NH40H—víz eleggyel, kétszer 20 ml vízzel, majd háromszor 35 ml nHCl oldattal, végül kétszer 20 ml vízzel extraháljuk. A kloroformos részt vízmentes Na2S04-on szárítjuk, szűrjük, kloroformmal mossuk, majd a kloroformos oldatot bepároljuk. A visszamaradó habot 35 ml THF és 50 ml etil-acetát elegyében oldjuk, szűrjük, és 30 ml 1:2 arányú THF-etilacetát eleggyel mossuk. Az oldat bepárlása után a visszamaradó szilárd habhoz 100 ml dsetil-étert adunk. Szűrjük, éterrel mossuk, és vákuumban szárítjuk. A kissé higroszkópos szilárd anyag súlya: 9,69 g (98%). Op. 125 °C [a]20 = -42,5° (c=l, MeOH) Rf =,0,5; Rf = 0,72 b) Z-Leu-Arg (NOi)-Pro-NHEt Molekulasúly = 578,65 5,6 g (11,73 mmol) Z-Arg(N02)-Pro-NHEt védett dipeptid-etilamidot feloldunk 30 ml jégecetben. Az oldathoz 55 ml 4 n jégecetes HBr oldatot adunk. A rekacióelegyet másfél órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldathoz 250 ml absz. étert adunk, majd az elegyet 1 órán át állni hagyjuk. A kivált anyagról a felülúszót dekantáljuk, és a maradékhoz 100 ml étert adunk. 15 perc állás után szűrjük, és éterrel bőven mossuk. A higroszkópos szilárd anyagot vákuumban foszfor-pentoxid és nátrium-hidroxid jelenlétében szárítjuk. A kissé higroszkópos anyag súlya: 6,44 g. A fenti dipeptid-etil-amid-hidrogén-bromidból 6,04 got (11,0 mmol) szuszpendálunk 150 ml kloroformban. A szuszpenzióhoz 5,5 ml trietil-amint (TEA) adunk. A szuszpenzió lassan oldódik, a teljes feloldás érdekébentovábbi 2,5 ml TEA-t adunk hozzá. Ezután 6,4 g Z-Leu- OPCP 65 ml kloroformban készült oldatát csurgatjuk a reakcióelegybe, és éjszakán át keverjük. A reakcióelegyet 1 n sósav oldattl, telitett NaCl oldattal, majd 2 n ammónium-hidroxid oldattal, végül ismét telített NaCl oldattal extraháljuk. A koloroformos oldatot vízmentes Na2S04-on szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A 2 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
