185535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin-származékok előállítására
1 185 535 2 Termelés: 7,58 g (81,2%) Op. 166-169° [a]«= -22,3° (c=0,5 DMF) R; = 0,50; RJ = 0,14 f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe Molekulasúly = 716,8 7.0 g (15 mmol) Glp-His-Trp-N2H3-ot (az 1. példa e) lépésének terméke) feloldunk 60 ml dimetil-formamidban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd keverés közben hozzáadunk 7,5 ml (45 mmol) 6 n HC1 oldatot. Ezután lassan az elegybe csepegtetjük 1,035 g (15 mmol) NaN02 tömény vizes oldatát, és további 15 percig 0 °C-on keverjük, majd a reakcióelegyhez adjuk 4,78 g (15 mmol) H-Ser-Tyr-OMe • HC1 15 ml DMF-ban készült oldatát. 6,25 ml (45 mmol) trietil-aminnal az elegy pH-ját semlegesre állítjuk, és az elegyet éjszakán át 0—4 °C-on keverjük. Másnap vákuumban szárazra bepároljuk, és az olajos anyagot éterrel eldörzsöljük. A kapott porított anyag súlya 12,1 g (100%); két kismennyiségű szennyező foltot tartalmaz, azonban tisztítás nélkül hidraziddá alakítható, amely jól kristályosodik. Metanolból átkristályosított kontroll anyag fizikai állandói: Op. 188—190° [“]JD2 = -3,48° (c=l, DMF) R; = 0,58; Rj = 0,26 g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 Molekulasúly = 716,8 12 g nyers, porított Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe pentapeptid-észtert feloldunk 200 ml metanolban, hozzáadunk 10 ml 98%-os hidrazin-hidrátot, és az elegyet 3 órán át 40 °C-on keverjük. Az elegyet éjszakán át szobahőn keverjük, majd a kivált kristályokat kiszűrjük és exszikkátorban tömény H2S04 fölött szárítjuk. A szárított kristályos anyagot 250 ml 0,5 n HC1 oldatban oldjuk, majd telített Na2C03 oldattal pH 8-ra semlegesítjük, 2 órán át 0 °C-on állni hagyjuk, majd a kivált kristályokat szűrjük, jéghideg vízzel mossuk és szárítjuk. Termelés: 6,12 g (a két lépésre vonatkoztatva 56,9%) Op. 205-206° [“Id = 21,51° (c=l, DMF) R'f = 0,39; Rf = 0,14 Hidrazin nitrogén: talált: 3,79%, 3,76% elméleti: 3,91% h) BOC-D- Cpa-OPFP Molekulasúly = 465,8 6.0 g (20 mmol) BOC-D-Cpa-OH 50 ml etil-acetátban készült oldatát 0 °C-ra hűtjük, és 4,0 g (22 mmol) pentafluor-fenolt, majd 4,52 g (22 mmol) diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. Az elegyet 1 óra hosszat 0 °C- on, majd 1 órán át 20 °C-on keverjük, és ezután a kivált diciklohexilkarbamidot kiszűrjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk, és a maradékot etil-acetát és petroléter elegyéből átkristályosítjuk. Az anyagot jégszekrényben állni hagyjuk, majd szűrjük, etil-acetát és petroléter (1:1) elegyével mossuk, majd szárítjuk. Termelés: 7,8 g (84%) Op. 134-135 °C [a]ff= +23° (c=l, MeOH) R‘ = 0,75 Elemzési eredmény C20H17O4NClF5 összegképlet alapján: számított: C 51,57; H 3,67; N 3,00; Cl 7,61; talált: C 51,52; H 3,66; N 3,05; Cl 7,58; i) BOC-D-Cpa-Leu-Arg (N02)-Pro-Gly-NH2 Molekulsúly = 767,28 1,5 g (2,5 mmol) H-Leu-Arg(N02-Pro-Gly-NH2-trifluor-acetát sót [N. Yanaihara et al., J.Med. Chem. 16, 373 (1973)] oldunk 15 ml dimetil-formamidban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és hozzáadunk 1,16 g (2,5 mmol) BOC-D-Cpa-OPFP aktívésztert. Ezután a reakcióelegy pH-ját 5 mmol trietil-aminnal semlegesre állítjuk, és 30 percen át °C-on, majd 1 óra hosszat 20 °C-on keverjük. A dimetil-formamidot vákuumban 45 °C alatt eltávolítjuk. A maradékot előbb éterrel, majd vízzel eldörzsöljük, szűrjük és szárítjuk. Termelés: 1,82 g (95%) Op. 134-135 °C Rf = 0,8; R, = 0,5 R f6 = 0,5 Aminosav analízis: Cpa 1,05; Gly 1,00; Leu 1,02; Pro 0,92; Arg 0,95 j) H-D-Cpa-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 • 2HF Molekulasúly = 662,15 300 mg (0,39 mmol) az i) lépésben előállított védett pentapeptidet szuszpendálunk 0,9 ml anizolban, majd —80 °C-on 30 ml hidrogén-íluoridot kondenzálunk rá teflon reakcióedényben. 45 percen át 0 °C-on keverjük, majd a hidrogén-fluoridot ledesztilláljuk. A visszamaradó anizolos oldathoz abszolút étert öntünk, és a kicsapódó anyagot egyórás állás után szűrjük, éterrel többször mossuk és nátrium-hidroxid felett szárítjuk. Termelés: 220 g (85%) Op. 169-181 °C [a]D = -0,37 (c=0,5, H20) Rf = 0,5; Rf = 0,1 R‘ = 0 Rf8 = 0,45 Rf10 = 0,35; Aminosav analízis: Cpa 1,0; Arg 1,0; Pro 1,01; Gly 0,95; Leu 1,0; k) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D- Cpa-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 Molekulasúly = 1324,9 36 mg (0,05 mmol) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 pentapeptid-hidrazidot oldunk 1 ml dimetil-formamidban. az oldatot —10 °C-ra hűtjük, és keverés közben 33 p\ (0,2 mmol) 6 n sósavat adunk hozzá. Az elegy hőmérsékletét továbbra is —10 °C-on tartva keverés közben 3,8 mg (0,055 mmol) nátrium-nitrit tömény vizes oldatát adjuk hozzá, majd további 10 percen át keverjük —5 és —10 °C között. Ezután 35,3 mg (0,055 mmol) D-4-klór-fenil-alanil-leucil-arginil-prolil-glicin-amíd-hidrogén-fluorid-só 1 ml dimetil-formamidban készült és lehűtött oldatát adjuk a fentebb elkészített azid oldatához, majd a reakcióelegy pH-ját trietil-aminnal 7—8-ra állítjuk. Egy órán át —5------10 °C-on, majd 1 órán át 0 °C-on keverjük, és éjszakán át jégszekrényben állni hagyjuk. Másnap vákuumban bepároljuk. A visszamaradt nyers dekapeptidet Sephadex G—25 oszlopon (3 x 100 cm) (Pharmacia, Uppsala, Svédország) megoszlási kromatográfiával butanol:propanol:ecetsav:víz (15:1:4:20) elegyben tisztítjuk. 5 ml-es frakciókat gyűjtve UV abszorpcióval, illetve vé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
