185454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás endoproteináz-Lys-C kinyerésére
1 385 454 2 2. táblázat A 2. táblázat mutatja a találmány szerinti enzim eltéréseit lysebacterben eddig talált proteázoktól EC-szám Molekulasúly Reakciómechanizmus Specifitás a-litikus proteináz 3.4.21.12 20 000 D szerin-proteáz semleges aminosavak karboxilcsoportja, kivéve alanint /3-litikus proteáz 19 000 D Zn-metalloproteináz hidrofób aminosavak karboxilcsoportja; oldja a bakteriális sejtfalakat AL-I proteináz I 3.4.99.29 9 000 D (gélszűréssel), 14 000 D (ülepedési állandóból) ismeretlen hidrofób aminosavak, oldja a bakteriális sejtfalakat (különösen gram-pozitívakat) AL-I proteináz II 3.4.99.30 17 000 D ismeretlen lizin aminocsoportja Endoprpteináz-Lys-C 36-38 000 D (red. SDS-gél), kb. 35 000D (Sephacryl S-300) szerin-proteáz lizin karboxilcsoportja A proteineknek a tenyészfolyadék szűrletéből való le- 30 választása célszerűen ammónium-szulfáttal végzett kicsapással történik, bár más szokásos protein-lecsapószerek is használhatók, amelyek a benne lévő aktív proteinek enzimaktivitását nem befolyásolják. Ammóniumszulfát hozzáadásakor ezt célszerűen 2,5— 3,5 mólos, 35 előnyösen 3—3,2 mólos koncentrációig alkalmazzuk. Az ekkor képződő csapadékot elválasztjuk, például szűréssel, és ez tartalmazza az összes keresett aktivitást. Vízzel való feloldás és a maradék ammónium-szulfát célszerűen dialízissel történő eltávolítása után az így kapott 40 oldatot vagy az a2-makroglobulin-fémkomplex-kromatografálásnak vetjük alá, vagy további előtisztítást hajtunk végre. Ha további előtisztítás kívánatos, akkor célszerűen ammónium-szulfátos frakcionálást végzünk, ahol a 2 és 45 3 mólos ammónium-szulfát koncentráció között kiváló frakció tartalmazza a kívánt aktivitást. Ekkor célszerűen első fokozatban 0,7—1,3 mólig adunk hozzá ammóniumszulfátot, a csapadékot leválasztjuk, és utána 3 mólra, előnyösen 2,25—2,32 mólra növeljük az ammonium- 50 szulfát koncentrációját, és az akkor kapott aktív csapadékot szokásos módon leválasztjuk, és a visszamaradt ammónium-szulfáttól dialízissel megtisztítjuk. Amennyiben az így kapott oldatot nem vetjük alá az a2 -makroglobulin-fémkomplexes kezelésnek, végez- 55 hető még egy acetonos frakcionálás, és közbeiktatható egy molekulaszűrőn végzett kromatografálás is. Acetonos frakcionálás esetében 0,3—1,5 térfogat,-előnyösen 0,5—1,2 térfogat aceton hozzáadásával végezzük a lecsapást, a csapadékot leválasztjuk, és további 1,2 tér- 60 fogat acetont adunk hozzá, a csapadékot ismét leválasztjuk, és ezt 7,5—9 pH-jú pufferban oldjuk. A puffer koncentrációja célszerűen 0,01 és 0,05 mólos közötti. A maradék aceton eltávolítására szolgáló dialízis és a kapott oldat esetleges töményítése után valamilyen molekula- 65 szitán, például térhálósított dextránon, például Sephadex-G-100-on kromatografálunk, amikor a kívánt aktivitás; a kezdetkor eluáljuk az oszlopról, míg az ismert Al-1 proteináz I csak a vége felé eluálódik. Az eluátumot esetleges töményítés után hordozóhoz kötött a2-makroglobulin-fémkomplexen kromatografáljuk, amikor a keresett endoproteináz-Lys-C átfut az oszlopon. Az eluálás célszerűen 7,0—8,5 pH-tartományban 0,03-0,08 mólos pufferkoncentrációnál történik. A szokásos, ebben a tartományban hatásos pufferanyágok megfelelők, előnyös a tris-puffer, HEPES-puffer, [4-(2-hidroxi-etil)-lpiperazin-etán-szulfonsav] és foszfát-puffer. Jó eredményeket értünk el 6,5—9 pH-nál és 0,01—0,1 puffertarta<omnál. Az eluátum tiszta endoproteináz-Lys-C-t és puffert tartalmaz, és közvetlenül liofilizálható. A találmány szerinti új enzim főleg proteinek és peptidek szekvenciameghatározására használható. Nagyon fajlagos hasítási képessége alapján gyógyászatiig is alkalmazható, például véralvadási zavaroknál, illetve olyan más betegségeknél, amelyeknél proteinláncok hasítása szükséges. A következő példák szemléltetik a találmány szerinti enzim kinyerését és meghatározását. Az 1. példában az Endoproteináz-Lys-C kinyerésére kiindulási anyagként alkalmazott baktérium-tenyészfoly; dék szűrletet a következőképpen kapjuk. Az R. S. Wolfe-tól [Dept, of Mikrobiology, University of Illinois, Urbana/USA] származó és ATCC 27796, ill. DMS 1895 sz. alatt hozzáférhető organizmust 1 %-os Difco-élesztőkivonatból álló közegre vive ampullákban folyékony nitrogénben tároltuk, illetve ugyanilyen közeggel és adalékként 1,5 % agarral rendelkező ferde csövecskékbe, illetve agarlemezekre viszünk, legalább 7 napos átoltási ritmust tartva. Szilárd táptalajon tartott kultúrákból kiindulva, az 3
