185454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás endoproteináz-Lys-C kinyerésére
1 185 454 organizmust folyékony közegen tenyésztjük, eközben az inokulum-térfogat 1—10%. A főkultúrában levegőztetés közben (0,2—.1,0 térfogat közegtérfogat) 30 °C-on erőteljes keverés közben pH 7,2—7,8-nál, előnyösen pH = 7,4-nél körülbelül 18— 24 órán át fermentálunk. A sejteket centrifugálással elkülönítjük és az így kapott tenyész-felülúszót az enzim elkülönítésére alkalmazzuk. 1. példa Endoproteináz-Lys-C kinyerése Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796j-ból. Kiindulási anyag: 206 liter Lysobacter tenyészfolyadék-szűrlet. 206 liter Lysobacter tenyészfolyadék-szűrletet lassan telítünk 3—3,2 mólosig szilárd ammónium-szulfát hozzáadásával. A kevés pelyhes csapadékot kiszűrjük. A szűrőn maradó csapadékot kevés desztillált vízzel oldjuk, cs szilárd ammónium-szulfáttal 0,9 mólosra (1,3—3 mól) telítjük, és centrifugáljuk. A felülúszót tovább telítjük ammónium-szulfáttal 2,25-2,32 mólosra, és a csapadékot kiszűrjük vagy centrifugáljuk, majd körülbelül 400 ml desztillált vízzel oldjuk, és áramló csapvízzel dializáljuk. A dializátumot 0,5—1,2 térfogat —20 °C-os acetonnal elegyítjük, és centrifugáljuk. A (tiszta) felülúszót további 1,2 térfogat (a kiindulási térfogatra számítva) acetonnal elegyítjük, a csapadékot centrifugáljuk, és a lehető legkevesebb 0,025 mólos, 9 pH-jú tris-pufferban oldjuk, és 10 liter ugyanilyen pufferral szemben dializáljuk. A dializátumot egy Sephadex-G-100 töltetű oszlopba öntjük, amelynek méretei a következők: átmérő: 5 cm; hossz: 150 cm; oszloptérfogat: körülbelül 2,9 liter. Az oszlopot 0,025 mólos, 9 pH-jú trisz-pufferral egyensúlyba hozzuk, és az anyag betöltése után ugyanilyen pufferral mossuk. A Lysobacter-proteáz az elején eluálódik. Az eluátumot szilárd ammónium-szulfáttal 3,2 mólosig telítjük, és centrifugáljuk. A csapadékból készített tömény oldatot 0,05 mólos 8,0 pH-jú tris-pufferral szemben dializáljuk. * A további tisztításra agarózhoz kovalensen kötött a2- makroglobulin-cink-komplexet használunk. Egy 3 cm átmérőjű, 17,5 cm hosszú oszlopba 110 ml ilyen hordozót töltünk, és 0,05 mólos, 8,0 pH-jú tris-pufferral addig mossuk, amíg az átfolyóban már nincs protein. Ezután feltöltjük a dializátumot, és 0,05 mólos, 8,0 pH-jú tris-pufferral utánamossuk. A proteináz-Lys-C átmegy. Az átfolyót 0,05 mólos 8,0 pH-jú glicin-pufferral szemben dializáljuk, és 0,4 mg/ml-re hígítjuk ugyanezzel a pufferral, és liofilizáljuk. Össz-kitermelés: körülbelül 50—140 mg protein, 6— 23 egység/mg proteináz-Lys-C, Chromozym TH aktivitás < 0,2 %. 2 2- példa Az endoproteináz-Lys-Cmeghatározása. Az oldatok elkészítése: 1. 0,025 mólos tris, 0,001 mólos EDTA, pH 7,7. 0,303 g trist, 37,2 mg EDTA-t körülbelül 80 ml kétszer desztillált vízben oldunk, és a pH-t 2 n sósav oldattal 7,7-re állítjuk, és 100 ml-re feltöltjük. 2. Chromozym-PL (14 pmól/ml). 9 mg Chromozym-PL-t 1 ml kétszer desztillált vízben oldunk. 3. Endoproteináz-Lys-C oldat. 10 mg liofilizátumot 1 ml készer desztillált vízben oldunk. Használat előtt az 1. oldattal 1:100-ta hígítunk. Kivitelezés: 405 nm, 1 cm félmikroküvetta, 25 °C, teszt-térfogat 1,07 ml. A küvettába bepipettázunk: Imi 1. oldatot, 0,05 ml 2. oldatot, összekeverjük, és körülbelül 2 percig 25 °C-on temperáljuk. Hozzáadunk 0,02 ml 3. oldatot, összekeverjük, és a lineáris fázisból körülbelül 5 perc múlva a AE/perc-t mérjük. Számítás: AE/perc X 1,07-----rnTTsTTTTvl------X 100 = egység/ml endoproteináz-10,4X0,0- LysC Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás endoproteináz-Lys-C enzim - amely enzim 35000-38000 Dalton molekulasúlyú láncból áll, pH optimuma 7,7-nél van, és aprotinin gátolja, viszont a2- makroglobulin, on -antitripszin és etilén-diamin-tetraecetsav nem gátolja — kinyerésére, azzal jellemezve, hogy valamilyen Lysobacterales rendbe tartozó baktériumtörzs megszűrt és/vagy kívánt esetben előtisztított tenyészfolyadékát hordozóhoz kötött a2 -makroglobulinfémkomplexen kromatografáljuk, és az enzimet a szűrletből kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás íoganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0,01-0,1 mólos, 6,5— 9 pH-jú pufferban kromatografálunk. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás íoganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796) törzs tenyészetéből származó tenyészfolyadékot használunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyészfolyadék előtisztítása során megszűrt tenyészfolyadékból a proteint ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a csapadékot újraoldás után 1,3 és 3 mól ammőniiirh-'szulfát koncentráció kö-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
