185454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás endoproteináz-Lys-C kinyerésére
1 185 454 2 Különböző célokra, főleg proteinek és peptidek, például a szekvenciameghatározás keretében végzett célzott hasítására technikai és tudományos érdekességűek olyan endoproteinázok, amelyek valamilyen meghatározott helyen hasítanak. Gombákból ismert már egy, a peptidkötést a lizin C-terminális végén hasító endoproteináz. Ez az enzim azonban nehezen hozzáférhető, és ezért nem áll kívánt mennyiségben rendelkezésre. Most találtunk egy hasonló specifítású enzimet baktériumokban, amelyet endoproteináz-Lys-C-ként jellemeztünk, és amely más bakteriális proteázoktól tulajdonságaiban jelentősen különbözik. A baktériumokból nyert, találmány szerinti új endoproteináz-Lys-C-re jellemző, hogy egy 35000-38000 Dalton molekulasúlyú láncból áll, pH-optimuma pH 7,7- nél van, és aprotinin gátolja, a2-makiOglobulin, aj-anti-' tripszin és etilén-diamin-tetraecetsav viszont nem gátolja. A találmány szerinti enzim nem redukáló körülmények között aggregálódásra hajlamos, milcoris előnyösen körülbelül 150000 Dalton molekulasúlyú tetramerek és körülbelül 300000 Dalton molekulasúlyai oktamerek képződnek, amelyek enzimatikusan aktívak. Az új enzim pH-optimuma - amint már említettük — 7,7 pH-nál van 37 °C-on az azokoll-módszerrel meghatározva. [J. Bact. 91, 524 (1966)]. Elektrofókuszálásnál az enzim számos sávra hasad fel, amelyek csaknem a teljes pH-tartományra kiterjednek. Ez a viselkedés arra enged következtetni, hogy glükoproteinről van szó; az enzim izoelektromos pontja ezért nem határozható meg. Amint már említettük, a2 -makroglobulin, a, -antitripszin és etilén-dianún-tetraecetsav (EDTA) 10~2 mól/ liter koncentrációig nem gátolnak. Benzamidin ellenben 2,5 mmól/1 koncentrációnál körülbelül 50 %-ot gátol; a benzamidia-koncentráció emelésével 70%-os gátlás érhető el. Teljes gátlást a protinin okoz. Az új enzim szubsztrátspecifitását az 1. táblázat mutatja. Fajlagos aktivitása tozil-glicil-prolil-lizü-(p-nitro)anÜiddel mérve 25 °C-on körülbelül 25 egység/mg vagy körülbelül 50 azokoll-egység/mg enzim 37 5C-on. A Lysobacterből nyert proteináz Il-vel ellentétben a találmány szerinti enzim nem a lizin amino-végén, hanem a karboxil-végén hasít. A nagy specifitást mutatja a sávok kis száma is, amelyek az ezen enzimmel kapott fibrin hasítási termékek gélkromatográfiájánál fellépnek. A találmány szerint az említett enzimet úgy nyerjük ki, hogy az ezen enzimet kielégítő mennyiségben termelő mikroorganizmusok, főleg a Lysobacterales rendbe és itt előnyösen a Lysobacteraceae családba, például a Lysobacter (amelyet Myxobacter-nak is neveznek) nemzetségbe tartozó baktériumtörzs megszűrt és/vagy kívánt esetben előtisztított tenyészfolyadékát hordozóhoz kötött a2-makroglobulin-fémkomplexen kromatografáljuk és az enzimet a szűrletből kinyerjük. Az előtisztítást szokásos enzimtisztítási módszerekkel, például ammónium-szulfátos frakcionálással, acetonos frakcionálással és molekulaszűrős kromatografálással végezzük, így megszabadítjuk a legtöbb szennyeződéstől. Az új enzimtisztítási eljárási lépésnek a során a nehezen eltávolítható szennyeződések, de főleg a kísérő preteázok leválnak, míg a találmány szerinti endoproteináz-Lys-C oldatban marad, és innen elkülöníthető. I. tdblá7.at Endoproteináz-Lys-C szubsztrátspecifitása Szubsztrát Lebontás endoproteináz-Lys-C-vel Azokoll + Kazein + Fibrinogén + Hemoglobin + TLME +4-Chromozym PLR +4-S 2251R ++ Tozil-arginin-metil-észter — Chromozym THR — BAEE — Leucin-p-nitro-anilid — Lizin -p-nitro-anilid — ATEE — Inzulin B-lánca Rövidítések: TLME = tozil-lizin-metil-észter BAEE = benzoil-arginin-etil-észter ATEE = arginin-tirozin-etil-észter Chromozym PLR = tozil-glicil-prolil-lizin-p-nitroanilid Chromozym THR = tozil-glicil-prolil-arginin-p-nitroanilid S 2251R = valil-leucil-lizil-p-nitro-anilid. A fent említett a2-makrog)obulin-fémkomplexben a fém a Zn, Co, Ni és/vagy Cu csoportból valamilyen kétértékű fém. Ezen komplex alkalmazását és előállítását az egyidejűleg benyújtott 30 34 043.3 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali irat ismerteti részletesebben. Amint már említettük, közvetlenül a tény észfolyadékból kiindulva elvégezhető a hordozóhoz kötött a2- makroglobulin-fémkornplexszel történő találmány szerinti kezelés. Célszerűbb azonban a proteineket előbb más anyagoktól elválasztani, és előfrakcionáiást végezni. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2
