185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására
1 185 4-6 2 many szemléltetésére szolgálnak, de a találmány oltalmi körét nem korlátozzák. I. példa 360 mg sertés A-láncú S-szulfonátot 36 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH 10,5) oldunk, és az elegyet 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. 300 mg sertés B-láncú S-szulfonátot 30 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH 10,5) oldunk, és az elegyet 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. 123,4 mg ditiotreitolt 4 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 0,2 ml 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. Az A- és B-lánc oldatait egy 100 ml-es lombikban szobahőmérsékleten (kb. 25 °C) összeöntjük, és 1,91 ml ditio-treitol-oldatot adunk hozzá, hogy az -SH csoportnak -SSOa csoportra viszonyított aránya 1,04 legyen. A kapott oldatot nyitott főzőpohárban mágneses keverő - vei 4-8 °C hőmérsékleten 20 óra hosszat enyhén keverjük. Nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) 193,8 mg inzulint, vagy 29 % összes proteint mutat. Ebből az oldatból 40 ml-t ecetsavval 3,15 pH-ra beállítunk. Az oldatot gélszűréssel 5 X 200 cm-es Sephadex G-50 (Superfine) oszlopon szűrjük, és az egyensúly beállta után az oszlopot 3 mól ecetsavval 4—8 °C hőmérsékleten eluáljuk. Az inzulin csúcsnak megfelelő frakciót (2450—2700 ml) egyesítjük, és liofilizáljuk. Kitermelés: 95 mg inzulin, vagy 25 % összes fehérje. A sertésinzulin poliakrilamid-gél elektroforézis, aminosavanalízis, inzulin radioreceptor vizsgálat, HPLC és házinyúl vércukor csökkenési teszt szerint teljesen tiszta. 2. példa Szarvasmarha A- és B-láncú S-szulfonátokból 0,01 mól glicin-pufferben (pH 10,5) 5 mg/ml koncentrációjú oldatokat készítünk. Mindegyik oldat pH-ját 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-puffeTben (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 0,15 ml 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. A B-lánc 0,5 ml oldatához szobahőmérsékleten (kb. 25 °C) 0,8 ml A-láncú oldatot, és 0,035 ml ditiotreitol oldatot adunk, így az -SH csoportnak -SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 0,91. A kapott oldatot 4-8 °C hőmérsékleten 3 ml-es nyitott ampullában 20 óra hosszat keverjük. Az elegy HPLC analízise 1,96 mg szarvasmarha-inzulin kitermelést, vagy 30 % összes fehérjét mutat. 3. példa A sertés A- és B-láncú S-szulfonátok oldatait 10 mg/ml koncentrációban, 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) készítjük el. Mindegyik oldat pH-ját 5 n nátriumhidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 2,0 ml üvegben desztillált vízben oldunk. Szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) 0,5 ml B-láncú oldathoz 0,6 ml A-láncú oldatot és 29,25 pl ditiotreiíololdatot adunk, így az -SH csoportnak -SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,00. A kapott oldatot 3 ml-es nyitott fiolában 4-8 °C hőmérsékleten 20 óra hosszat keverjük. HPLC analízis az oldatban 3,81 mg sertésinzulin kitermelést, vagy 35 % összes proteint mutat. 4. példa Emberi (hasnyálmirigy) B-lánc S-szulfonátból, és különféle emberi (hasnyálmirigy és E. coli) és sertés (hasnyálmirigy) A-lánc S-szulfonátból 50 mg/ml koncentrációban, 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldatokat készítünk. Mindegyik oldatot 5 n nátrium-hidroxidoldattal 10,5 pH-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk és a pH-t 0,16 ml 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. Mindegyik 1,0 ml A-láncú S-szulfonát oldatokhoz szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) 0,5 ml B- láncú S-szulfonát-oldatot, és 0,05 ml ditiotreitol-oldatot adunk, így az -SH csoportnak -SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,09. Mindegyik oldatot hűtött helyiségben (4—8 DC), nyitott fiolában 20—22 óra hosszat keverjük. A kitermelés kiszámításához az oldatokat HPLC analízissel hasnyálmirigyből nyert emberi inzulin, mint standard, alkalmazásával vizsgáljuk. Az eredményeket a következő táblázat mutatja. 1. Táblázat A-lánc eredete Emberi inzulin kitermelés, mg Összes proteinhez viszonyított kitermelés % sertés (hasnyálmirigy) 2,00 26,7 sertés (hasnyálmirigy) 2,11 28,1 emberi (hasnyálmirigy) 1,95 26,0 emberi (hasnyálmirigy) 2,03 27,1 emberi (E. coli) 1,99 26,5 5. példa Emberi A- és B-lánc S-szulfonát mindegyikéből 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Mindegyik oldat pH-ját 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és a pH-t 0,16 ml 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re beállítjuk. 0,5 ml B-láncú oldathoz szobahőmérsékleten 1 ml A-láncú oldatot, majd 50 pl ditiotreitololdatot adunk, így az — SH csoportnak az —SSOj csoporthoz viszonyított aránya 1,09. A kapott oldatot 3 ml-es nyitott fiolában 4-8 °C hőmérsékleten 22 óra hosszat keverjük, majd HPLC analízissel vizsgáljuk. Az emberi inzulin kitermelése 2,58 mg, vagy 34 % összes fehérje. 6. példa 328 mg emberi A-lánc S-szulfonátot 65,6 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 75 pl 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
