185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására
185 416 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk. 164 mg emberi B-lánc S-szulfonátot 32,8 ml 0,1 mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 15 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1 mól glicin-pufferben 5 (pH 10,5) oldunk, és az oldatot 160 pl 5 n nátriumhidroxid-oldattal 10,5 pH-ra beállítjuk. Az A- és B-láncú oldatokat egy 150 ml-es üveg főzőpohárban szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) egyesítjük, és 3,28 ml ditiotreitol-oldatot adunk hozzá, így 10 az —SH csoportnak az —SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,09. A nyitott főzőpoharat hűtött helyiségben jeges vízfürdőbe tesszük és 30 percig erősen keverjük. Az oldatot hűtött helyiségben (4-8 °C) 24 óra hosszat tovább keverjük. Ebben az időben a HPLC analízis 15 148 mg emberi inzulin kitermelést, vagy 30% összes proteint mutat. 100 ml ilyen oldathoz 25 ml jégecetet adunk, a végső pH 3,15. Az egész mintát gélszűréssel 5X 200 cm-es Sephadex G-50 (Superfine) oszlopon szűrjük és az 20 oszlopot 1 mól ecetsavval 4— rk. Az eluált proteint liofilizáljuk. Az inzulin csúcsnak megfelelő frakció (2465—2781 ml-ből) 125 mg, és 29,4 % kinyert proteinnek felel meg. Ennek az inzulinnak egy részét (95,5 mg) 9 ml 0,01 25 mól trisz-puffer, 0,001 mól etilén-diamin-tetraecetsav, 7.5 mól karbamid, 0,03 mól nátrium-klorid pufferelegyben (pH 8,5) 4°C hőmérsékleten oldjuk. Az elegyet 2.5 X 90 cm (dietil-amino-etil)-cellulóz ioncserélő oszlopon kromatografáljuk, és azonos pufferrel mossuk. 30 A proteint 4-8 °C hőmérsékleten 1-1 liter 0,03 mól és 0,09 mól nátrium-klorid növekvő koncentrációját tartalmazó azonos pufferrel, majd 1 liter 1 mól nátriumkloridot tartalmazó pufferrel eluáljuk. Mindegyik frakciót Sephadex G-25 oszlopon 2 % ecetsavban sómente- 35 sítjük, és liofrlizáljuk. Az inzulin csúcsot tartalmazó frakció (elúciós térfogat 878—1008 ml) súlya 55,73 mg, mely 84 % kinyert proteint jelent. Cink-inzulin kristály előállításához üveg centrifugacsőben 11,90 mg inzulint 240 pl 0,1 n sósavban, majd 40 azonnal 2,16 ml 0,04 %-os cink-klorid, 0,05 mól nátrium-citrát, 15% aceton elegyben oldjuk. Az oldatot 72 óra hosszat szobahőmérsékleten (kb. 25 °C) kristályosítjuk, majd a felső folyadékot leöntjük. A kristályokat centrifugán 2000 ford/perc fordulattal kétszer 3 °C 45 hideg 6,1 pH-jú vízzel mossuk. A kristályokat analízishez 0,01 n sósavban újra oldjuk. A kapott emberi inzulin teljesen tiszta, melyet a poliakrilamid-gél elektroforézis (egyetlen csúcs), aminosavanaiízis, inzulin radioreceptor-vizsgálat, inzulin radio- 50 immun-vizsgálat, HPLC, danzilezés és UV-spektrum igazol. Az USP házinyúl vizsgálat (144 házinyúl) 26,3 ±1,8 egység/mg (vízmentes) hatékonyságot mutat. egyensúly beállta után az 8 C hőmérsékleten eluálj Emberi (E. coli) [N-formil-Gly1 ]-A-lánc S-szulfonát és emberi (hasnyálmirigyből) B-lánc S-szulfonát 5 mg/ml koncentrációjú oldatát 0,1 mól glicin-pufferben (pH 30 10,5) készítjük el. Mindegyik oldat pH-t 5 n nátriumhidroxiddal 10,5 pH-ra állítjuk be. 61,7 mg ditiotreitolt 4,0 ml 0,1- mól glicin-pufferben (pH 10,5) oldunk, és a pH-t 0,16 ml 5 n nátrium-hidroxiddal 10,5 pH-ra beállítjuk. Szobahőmérsékleten (25 °C) 0,5 mi B-láncú 65 S-szulfonát oldathoz 1,0 ml [N-formil-Gly1 ]-A-láncú S-szulfonát oldatot és 0,05 ml ditíotreitol oldatot adunk, így az —SH csoportnak —SSO3 csoporthoz viszonyított aránya 1,10. Az oldatot hűtött helyiségben (4—8 °C) 3 ml-es nyitott fiolában 23 óra hosszat keverjük, majd HPLC analízissel vizsgáljuk. Az [N-formil-Gly1 -A] emberi inzulin kitermelése 1,46 mg, vagy 19,5 % összes protein. Az oldat egy részét jégecettel 3,15 pH-ra savanyítva gélszűréssel 1,5 X 90 cm-es Sephadex G-50 (Superfine) oszlopon szűrjük, és az egyensúly beállta után 4—8 °C hőmérsékleten 1 mól ecetsavval eluáljuk. Az [N-formil- Gly1-A] emberi inzulin frakciókat (elúciós térfogat 87— 95 ml) egyesítjük, és egy részét liofilizáljuk. A protein HPLC és aminosav-analízis szerint teljesen tiszta. Az [N- formil-Gly1 -A] emberi inzulin bioaktivitása radioreceptor vizsgálattal értékelve 17%, az emberi inzulin standardhoz viszonyítva. 8. példa Sertés A-láncú S-szulfonátból, illetve emberi B-lánc S-szulfonátból külön-külön 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk 0,1 m glicin-pufferrel (pH =10,5). 2 ml A-lánc oldatra 1 ml B-lánc oldatot számítva A—B elegyet készítünk. Az A-B elegy pH-értékét 5 n nátriumhidroxiddal 10,5-re állítjuk. 121,2 mg ciszteint 2,0 ml 0,1 mól glicin-pufferban (pH = 10,5) oldunk és az oldat pH-értékét 0,35 ml 5 n nátriumhidroxiddal 10,5-re állítjuk. Az A-B elegy 1,5 ml-éhez szobahőmérsékleten 52 pl fenti cisztein-oldatot adunk, mellyel az —SH : —SSO3 arányt 0,95-re állítjuk. A kapott oldatot 4—8 °C hőmérsékleten nyitott 3 ml-es ampullákban 20 órán át keverjük, melynek elteltével a HPLC analízis 3,25 mg emberi inzulin kitermelést mutat (a teljes prolein 23,2 %-a). 9. példa A következő példában az emberi A- és B-lánc S- szulfonát kapcsolási reakciójának optimális teljes protein-koncentrációját vizsgáljuk. 0,1 mól pH = 10,5 glicin-pufferral 7 ml, 25 mg/ml koncentrációjú sertés A-lánc S-szulfonát-oldatot és 4 ml, 25 mg/ml koncentrációjú E. coli (ß-gal.) B-lánc S-szulfonát-oldatot készítünk, 6,0 ml A-lánc oldatot és 3,0 ml B-lánc oldatot egyesítünk, majd az oldat pH-ját 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5 pH-ra állítjuk be. 61,7 mg ditio-eritroitolt (DTT) oldunk4,0 ml 0,1 mól 10.5 pH-értékű glicin-pufferban, majd az oldat pH- értékét 140 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával 10.5 értékre állítjuk vissza. Ebből az oldatból 1,64 ml-t adunk az A- és B-láncot tartalmazó oldathoz. Ily módon az —SH/SSO3 arány 1,20, melyet korábbi vizsgálatok során 10 mg/ml proteinkoncentráció esetén optimálisnak találtunk. A kísérletek során az A- és B-lánc proteinkoncentrációjának változása nem befolyásolja jelentősen az optimális DTT koncentrációt. Az egyesített oldatot közvetlenül ezután II db 3 ml-es ampullába töltjük, melyek különböző mennyiségű 0,1 mól glicin-puffert tartalmaznak. (Lásd az alábbi táblázatot.) Az ampullákat egy éjszakán át 5 °C hőmérsékleten rázatjuk. 5
