185404. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pertusszisz toxoid előállítására
1 1. példa 185 404 2 Bordet-Gengou táptalajt, melyet burgonya, pepton nátrium-klorid, agar és szarvasmarha vérből készítettünk (pontos összetételt 1. Ann. Inst. Pasteur, 1906,20, 731), beoltottuk Bordetella pertussis Tohama I törzssel, és 32 °C-on 2 napig inkubáltuk, majd az áttetsző kerek kolóniákat leszedtük, és a K agglutinációs antitest aktivitású kolóniákat újra Bordet-Gengou táptalajon tenyésztettük, és így nyertük az oltótenyészetet. A tenyésztő-; táptalajt úgy készítettük, hogy Cohen-Wheeler táptalajt (összetételt lásd később 1. táblázatban) 121 °C-on 60 percig sterilizáltunk autoklávban, gyorsan lehűtöttük 40 °C-ra. A táptalajt 37 °C-on tároltuk. A fenti oltó tenyészettel beoltottuk a tenyésztőtáptalajt oly módon, hogy a sejtkoncentráció 200-300 millió sejt/ml legyen, alaposan elkevertük és Roux palackokba adagoltuk 0,2 i-es részletekben, majd 37 °C-on inkubálva tenyésztettük. Az inkubálás ideje a sejtek növekedési ütemétől függött. A maximális sejtnövekedés az ötödik napon volt megfigyelhető, amikor a tenyészet csirke eritrociták elleni hemoglutinációs titere szintén maximális értéken volt fáz „Infection and Immunity”, 7, 992-999 (1978) irodalmi helyen ismertetett módszer szerint mérve]. Ezért a tenyészeteket összegyűjtöttük és centrifugáltuk, majd 20,2 súly/térf.%-os ammónium-szulfátot adtunk a felülúszóhoz. Jól elkevertük és az elegyet állni hagytuk 4 °C-on. 7 nap után leszívattuk a felülúszót, az üledéket összegyűjtöttük és percenkénti 8000 fordulattal 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük. Az üledékhez térfogata tizedrészének megfelelő menynyiségű 1 mólos nátrium-klorid - 0,05 mólos foszfátpuffer (pH = 8,0) elegyet adtunk és jól elkevertük. Az elegyet újra állni hagytuk 4 °C-on 7 napig, majd centrifugáltuk és a felülúszót összegyűjtöttük (I. extraktum). Ennek a felülúszónak nagy volt a leukocitózis gyorsító faktor (a továbbiakban LPF), hisztamin szenzitizáló faktor (a továbbiakban HSF) és sejt nélküli endotoxin tartalma. (A mérési módszert lásd később.) Az I. extraktumot újra koncentráltuk, azonos térfogatú telített ammóniával pH = 8,0-ra beállított ammónium-szulfátot adtunk hozzá, és az elegyet állni hagytuk 4 °C-on. 7 napi állás után percenkénti 10 000 fordulattal 20 percig centrifugáltuk, az üledéket összegyűjtöttük és térfogata háromszázad (1/300) részének megfelelő mennyiségű 1 mólos nátrium-klorid - 0,05 mólos foszfátpuffert (pH = 8,0) adtunk hozzá. Alapos elkeverés után féligáteresztő membrán dialízis csövekbe helyeztük az ammónium-szulfát eltávolítása céljából, külső folyadékként pH = 8,0-as 1 mólos nátrium-klorid oldatot használtunk. A diaiizált koncentrátumot azután a következő szacharóz faj súly-gradiens centrifugálásnak vetettük alá. Az előzőleg sterilizált 1700 ml-es centrifuga forgórészt záróberendezéssel együtt alacsony fordulatszámmal forgattuk, és gradiens szivattyú segítségével 1300 ml 5 és 30 súly/térf.% közötti szacharózoldatot juttattunk bele. Azután 100 ml fenti diaiizált koncentrátumot és 300 ml fedőfolyadékot (0,5 mólos nátrium-klorid-oldat, pH “ = 8,0) adagoltunk. A forgórészt 98 400 g-vel 18,5 óra hosszat forgattuk. Centrifugálás után 34 súly/térf.%-05 szacharózoldatot adagoltunk alacsony fordulatszám mellett, és a forgórészben levő folyadékot 50-100 ml-es frakciókba gyűjtöttük (frakciók gyűjtése). A frakciók szedését az alacsony fajsúlyú szacharóz oldatoktól kezdtük, és a nagy hemoglutinációs titerű (HA) (több mint 20 titer/ml, előnyösen 500 titer/ml) és endotoxinszegény frakciókat gyűjtöttük. Az endotoxin hiányát nyulakon végzett pirogf nitási próba alapján ítéltük meg. Ezt úgy végeztük, hogy minden frakcióból vett mintát 100 °C-on melegítettünk 3 percig és 20 HA-titer/ml-re hígítottuk fiziológiás sóoldattal. Ezt a hígított oldatot intravénásán beadtuk nyulaknak 1 ml/testsúly kg dózisban. Azokat a frakciókat, amelyek 3 órán belül nem okoztak lázat, elkülön; tettük és összegyűjtöttük mint exotoxin tartalmú folyadékokat. Az exotoxin tartalmú folyadékot 1/250 mólos foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH = 7,0) mintegy 50 pg/ml fehétjeeredetű nitrogéntartalomig hígítottuk. Ebben a lépésben zselatint, Tween 80-at (polioxietilén-szorbitán-monooleát, Kao-Atlas, Japan) és tiomerzált adtunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a zselatinkoncentráció 0,32 súly/térf.%, a Tween 80 koncentráció 0,05 térf.% és a íiomerzál koncentráció 0,01 súly/térf.% legyen. Ehhez a folyadékhoz 39 °C-os inkubátorban, bázikus aminosav hozzáadása nélkül annyi formaiint adtunk, hogy annak koncentrációja az elegyben 0,2 térf.% legyen. Alapos keverés után egy napig inkubáltuk 39 °C-on,majd további fcrmalint adtunk hozzá, a formalinkoncentrációt 0,3 térf.%-ra állítottuk be. Alapos elkeverés után 2 napig inkubáltuk, majd további formalin adagolásával 0,4 térf.%-ra állítottuk be a koncentrációt, alaposan elkevertük és tovább inkubáltuk. A teljes inkubálás 5 napig tartott. A keletkezett flokkulált toxoidot tartalmazó szuszpenziót 0,01 térf.%-os formalinos fiziológiás sóoldattal mint külső folyadékkal szemben dializáltuk. A fenti sz iszpenzió dialízisét egy membrán dialízis csőben végeztük, és 12,5-szeres belső folyadékot használtunk a fent er ílített külső folyadékhoz képest. A dialízist 4 °C-on 2 napig végeztük, mialatt a külső folyadékot állandóan kevertük. A külső folyadékot 2 nap után frissel cseréltük ki és a dialízist megismételtük. A diaiizált flokkulá'um-szuszpenziót különböző pertusszisz vakcinák ellenőrzésére szolgáló tesztekkel vizsgáltuk. A végső té fogatra való beállítás előtt a flokkulált toxoid szuszpenziót 10 kHz-es ultrahangos kezelésnek vetettük alá 5 percig, majd 400-as lyukméretű szűrőn szűrtük, és így a végső pertusszisz toxoidot tartalmazó folyadékot kaptuk. Kontrollként a külső folyadékot formaiinna! kezeltük 0,05 mól L-lizin hozzáadása mellett, majd a fenti kezelésnek vetettük alá, így kaptuk a kontroll fo/adékot. A fenti módon kapott pertusszisz toxoidot tartalm izó folyadékot és a kontroll folyadékot Levine módszerével kezeltük (Reo Levine, Joseph L. Stone and Louise Wyman: Factors affecting the efficiency of aluminium adjuvant in diphteria and tetanus toxoid. J. Immunology 75, 301-30 7,1975). Eszerint mindkét folyadékot 1/250 mólos 7,0-es pH-jú foszfáttal pufferolt sóoldattal hígítottuk, 20 jug/ml vagy ennél kisebb fehéijeeredetű ni-rogéntartalom értékig. Azután alumínium-klorídot adtunk az oldalhoz, melynek koncentrációját 0,18 súly/ /térf.%-osra állítottuk be. Az elegyet alaposan elkevertük és pH-jáUósawal vagy nátrium-hidroxiddal 7,0-re állítottuk be. így alumíniummal kicsapott vakcinát kaptunk, melynek koncentrációja 0,2 mg alumínium/ml-ben kifejezve. Ennek a terméknek a tulajdonságait a 2. táblázatban foglaltuk össze. Statisztikai értékelés után azt találtuk,. hogy az LPF érték akkor elfogadható, ha annak értéke nem több mint 0,5 LP-egység/ml (LP-egység: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
