185404. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pertusszisz toxoid előállítására
1 185 404 2 A találmány tárgya eljárás pertusszísz toxoid előállítására. A szamárköhögés fertőző betegség, melyet a Bordetella pertussis nevű baktérium okoz, és melynek komoly következményei vannak, különösen gyerekeknél. A betegség megelőzésére vakcinát alkalmaznak. Ezek a vakcinák azonban — mivel a kórokozó baktérium teljes sejtjeiből állítják elő — lázat és más mellékhatásokat okoznak. Számos kísérletet végeztek már arra nézve, hogy a Bordetella pertussis I törzsből csak a hatásos komponenst izolálják és vakcinává alakítsák, az ajánlott eljárásoknak azonban egyike sem volt sikeres. Mivel M. Pittmann: „Reviews of Infectious Diseases” 1, 401412 irodalmi helyen közöltek szerint a Bordetella pertussis által okozott fertőzést a baktérium által termelt exotoxin okozza, felvetődött annak lehetősége, hogy a megelőzést pertusszísz íoxoiddai végezzék. Arra vonatkozó híradás azonban, hogy megfelelő pertusszísz toxoidot sikerült volna így előállítani, még nem ismeretes. A technika állása szerint a jelen találmány feltalálóinak sikerült először pertusszísz toxoidot detoxifikálási eljárással előállítani. A találmány tárgya a fentiek alapján eljárás olyan pertusszisz toxoid előállítására, amely kevéssé toxikus, immunizáló hatása azonban igen jó. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a tenyészet felülúszójából vagy annak koncentrátumából eltávolítjuk az endotoxint, és a keletkezett folyadékot formaldehiddel kezeljük a pertusszisz exotoxin flokkulálása céljából, mialatt bázikus aminosav nincs jelen. A találmány szerinti eljáráshoz Bordetella pertussis I törzs tenyészetének felülúszóját vagy annak koncentrátumát használjuk. A Bordetella pertussis I törzs tenyésztését önmagában ismert módon végezzük. Így például a törzset folyékony táptalajon (Cohen-Wheeler táptalaj, [összetételét 1. I. példában], Stainer and Schölte táptalaj [összetételét 1, J. of General Microbiol, (1971) 63, 211- 220], stb.) 35-37 °C-on 5-7 napig tenyésztjük. A kapott tenyészet felülúszóját szűréssel vagy centrifugálással választjuk el. Vagy magát a folyékony felüiúszót vagy annak koncentrátumát használhatjuk az utána következő lépésben, amikor az endotoxint elválasztjuk. A kpncentrátumot ismert módon kisózássa! készíthetjük. így például 10 1 felülúszóhoz 2—5 kg ammónium-szulfátot adunk, és keverés után a képződött csapadékot alkalmas módszerrel, pl. szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot feloldjuk alkalmas mennyiségű 1 mól nátrium-kloriddal kiegészített 0,05 mólos foszfátpufferben és a felüiúszót centrífugálásos ülepítésseí vagy ehhez hasonló módszerrel nyerjük ki, A találmány szerinti eljárással a fent leírt felüiúszót vagy annak koncentrátumát az endotoxin eltávolítása céljából kezdésnek vetjük alá. Az endotoxin eltávolítását szacharóz fajsúly-gradiens centrifugálással, kálium-tartarát fajsúly-gradiens centrifugálással, cézium-klorid fajsúly-gradiens centrifugálással, gélszűréssel vagy más módszerrel végezzük. Különösen előnyös módszer a fent leírt felüiúszót vagy annak koncentrátumát 0 és 60 súly% közötti szacharóz fajsúly-gradiensnél 62 000 és 122 000 g közötti gyorsulással 10—24 óra hosszat centrifugálni. A találmány szerinti eljárás leglényegesebb lépése a pertusszisz exotoxin flokkulálása. Ezt úgy végezzük, hogy a fent leírt módon nyert pertusszisz exotoxint tartalmazó folyadékot formaldehiddel kezeljük bázisos aminosav jelenlétének teljes hiánya mellett, így az exotoxint lényegében véve deíoxiíikáljuk és pertusszisz toxi-, dot nyerünk. így a kicsapott és tisztított vakcina, amely az így detoxifikált toxoidot tartalmazza és a kicsapott és tisztított pertusszisz-diftéria-tetanusz kombinált vakcina, amely szintén detoxifikált toxoidot tartalmaz, kevéssé toxikus, de nagy az immunizáló hatása. Ilyen hatást nem lehet elérni olyan pertusszisz toxoiddal, melyet úgy állítottak elő, hogy a pertusszisz exotoxint tartalmazó folyadékot formaldehiddel kezelték bázikus aminosav, különösen L-lizin jelenlétében. A szokásos baktérium exotoxinok esetében mint például a diftéria toxin esetén általában csak gyenge kötések képződnek a toxin molekulák és a formaldehid között, és így lehetetlen stabil polimerízáturnot kapni anélkül, hogy egy adalékanyagot, például bázikus aminosavat, azaz L-lizint ne adnánk az oldathoz. A pertusszisz exotoxin esetén azonban nem várt módon azt találtuk, hogy a formaldehides detoxifikálás ilyen bázikus aminosav hiányában elősegíti az exotoxin polimerizációját és így antigén flokkuiátumot nyerünk. Ez elősegíti az immunitás-kompetens molekulaméret növekedést, fokozza az immunogenitást és így lehetővé teszi a nagyhatású pertusszisz toxoid előállítását. A flokkuláiási kezelést úgy végezzük, hogy a pertuszszisz exotoxint tartalmazó folyadékhoz formaiint, (azaz formaldehidnek 37 súly/térf. %-os vizes oldatát) vagy vízzel hígított formaiint adunk lényegében véve bázikus aminosav, például L-lizin jelenléte nélkül (azaz 10 mmólnál kisebb koncentrációban lehet jelen). Az elegyet addig ínkubáljuk, míg a pertusszisz exotoxin lényegében véve detoxifikálódik. Előnyösen úgy járunk el, hogy a formaiint vagy hígított formaiint elkeverjük az exotoxint tartalmazó folyadékkal anélkül, hogy bázikus áminosavat adnánk hozzá, olyan mennyiségben, hogy az elegy formalin koncentrációja 0,1 és 0,6 térf.% között legyen. Az elegy formalin koncentrációját az inkubálás alatt esetleg adagolt további formaiinnal a fenti értékhatárok között tartjuk, és az inkubálást 32 °C és 42 °C között 3-14 napig folytatjuk. A fenti kezeléssel a pertusszisz exotoxint flokkulálva detoxifikáljuk, és egy flokkulált pertusszisz toxoidot tartalmazó szuszpenziót nyerünk. A keletkezett flokkulált toxoidot tartalmazó szuszpenziót valamilyen alkalmas módszerrel diszpergáljuk, például ultrahanggal 10- 50 kHz-nél és így folyékony toxoidot kapunk. A találmány szerinti eljárásban a fenti lépések közé egy dializálási kezelés iktatható be. A dialízist önmagában ismert módon hajtjuk végre. Ugyanúgy, mint a szamárköhögés vakcina teljes sejtekből való előállításakor, az így nyert pertusszisz toxoid folyadék is felhasználható kicsapott tisztított pertusszisz vakcina vagy kicsapott tisztított pertusszisz-diftéria-tetanusz kombinált vakcina előállítására és embereken való alkalmazására. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal illusztráljuk az oltalmi kör korlátozása nélkül. A találmány szerinti eljárásban felhasznált Bordetella pertussis Tohama I törzsének tulajdonságait például az „Infection and Immunity” 6, 899-904 (1972) irodalmi hely ismerteti. A törzset a National Institute of Health, Tokio, Japan (NIHJ) tartja fenn, és az Institute for Fermentation, Osaka, Japan IFO-14073 szám alatt van deponálva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 65 2
