185382. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására
1 185 382 2 10 ml diklór-difenil-szilánt tartalmazó 100 ml vízmentes toluolhoz adunk, és az elegyet 6 órán át visszafolyatás közben forraljuk. A kapott módosított kovasavat először 200 ml toluollal mossuk, majd Soxhlet-extraktorban 8-8 órán át egymás után 250-250 ml toluollal, acetonnal és metanollal kezeljük. Végül a szilárd anyagot a fent ismertetett módon trimetil-klórszilánnal kezeljük. Ezután 3-3 g hordozóanyagot 10,7 ml kloroform és 2,3 ml n-butanol elegyében szuszpendálunk, és a szuszpenziót 340 atmoszféra nyomáson 4,6X250 mm méretű, rozsdamentes acélból készült oszlopba töltjük. Ezután az oszlopokat 75-75 ml etanoUal mossuk. A kapott interferon-csúcs középső frakcióját 5,7 N sósavoldattal hidrolizáljuk, majd meghatározzuk az aminosavak mennyiségét. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük: Asx 15,4 17,6 17,95 15,2 Thr* 7,8 8,6 8,4 7,3 Ser* 7,7 8,3 9,1 9,9 Glx 24,1 21,1 21,4 n.h. Pro 2,8 n.h. n.h. 3,36 Gly -4,9 6,9 6,6 7,4 Alá 11,8 10,7 10,7 9,9 Cys n.h. 3,96 3,4 n.h. Val 6,9 7,84 8,2 6,9 Met 2,8 4,5 4,5 3,7 Ile 8,7 8,6 8,9 7,8 Leu 25,0** 25** 25** 25** Tyr 9,6 10,3 9,0 8,1 Phe 7,3 9,5 9,8 9,0 His 4,5 7,5 6,9 6,1 Lys 11,6 12,3 11,8 11,25 Arg 8,8 11,25 10,6 8,8 Trp n.h. n.h. n.h. 2,93 24 óra 24 óra 48 óra 24 óra TGS TGS TGS TGS TGS = tioglikolsav * = korrigálásán érték ** = vonatkoztatási érték nJi. = nem határoztuk meg. A difenil-csoportokat tartalmazó oszlopról leoldott interferon-csúcs középső frakciójából mintát veszünk, a mintát 0,02% tioglikolsavat tartalmazó 5,7 N sósavoldattal 110 °C-on 6, 14 és 24 órán át hidrolizáljuk, majd meghatározzuk a hexózaminokat. A mérés szerint az interferon molekulánként 3 glükózamin-csoportot tartalmaz; az elemzés sem galaktózamint, sem mannózamint nem mutatott ki. A végcsoport-meghatározáshoz a difenil-csoportokat tartalmazó oszlopról leoldott interferon-csúcs középső frakciójából származó 90 pmól súlyú mintát használtunk fel. A mérés szerint az interferon N-terminális aminosavként metionint (Met) tartalmaz. Fibroblaszt- és leukocyta-interferon 150—150 pmólos mintáit triptikus lebontásnak vetettük alá, majd a mintákat kromatografáltuk. A két mintában nem találtunk azonos peptid-fragmenseket. Fibroblaszt-interferon 1,25 nmólos mintájában meghatároztuk az aminosavak szekvenciáját. Az elemzés szerint a fehéije N-terminális aminosavként Met-t tartalmaz, a 3-10. aminosav szekvenciája pedig Tyr3-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10, ami megegyezik a Hunkapillar és Hood által közölt adatoknak [Biochemistry 17, 2124 (1978)]. A fibroblaszt-interferon további 5,9 nmólos mintájának elemzése alapján a következő N-terminális aminosav-szekvenciát kaptuk: H2N-Met1-Ser-Tyr-As- Leus-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser-Ser-Asn-Phels Gin- ...Gln-Lys19-___ 4. példa Emberi fibroblasztból (GM 2504A sejtvonal) nyers interferont különítünk el. A nyers interferonhoz annyi telített, vizes nátriumklorid-oldatot adunk, hogy a kapott oldat nátriumklorid-koncentrációja 1 mólos legyen. Az így kapott oldatot Blau Sepharose-4B oszlopra visszük fel [térfogat: 20-25 ml, átmérő: 2,5 cm, átfolyási sebesség: 2,5 ml/perc]. A nyersanyagot a felvitel során jéggel hűtjük. A felvitel után az oszlopot 2.5 ml/perc útlolyási sebességgel 250 ml oldattal mossuk, amelynek összetétele a következő: 30% etilénglikol, 2 mól NaCl, 50 millimól Na2HP04 (pH = 7,2). Végül az interferont 2,5 ml/perc átfolyási sebességgel 250 ml oldattal eluáljuk, amelynek összetétele a következő: 50% etilén-glikol, 1 mól NaCl, 50 millimól Na2HP04 (pH = 7,2). Az oszlopon átfolyt oldatok jellemző elemzési adatai a következők: az aktivitás 5 %-a az átfolyt interferon-oldatban jelenik meg; az aktivitás 15 %-a a 30%-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg; az aktivitás 85 %-a az 50%-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg. Az első blau sepharose-oszlopról távozó, az interferon-csúcsnak megfelelő frakciókat egyesítjük, és az egyesített oldat etilén-glikol-tartalmát pufferoldattal (2 mól NaCl, 50 millimól Na2HP04; pH = 7,2) 10 térfogat %-ra állítjuk be. A kapott oldatot blau sepharose-oszlopra visszük fel [térfogat: 20-25 ml, átmérő: 2,5 cm, átfolyási sebesség: 2.5 ml/perc]. Az oszlopot 250 ml, 2 mól nátrium-kloridot, 50 millimól dinátrium-hidrogén-foszfátot (pH = = 7,2) és 30 térfogat % etilén-glikolt tartalmazó oldattal mossuk, majd 2 mól nátrium-kloridot, 50 millimól dinátrium-hidrogén-foszfátot (pH = 7,2) és 50 térfogat% etilén-glikolt tartalmazó oldattal eluáljuk. Az oszlopon átfolyt oldatok jellemző aktivitáselemzési adatai a következők: az aktivitás 10 %-a az átfolyt interferon-oldatban jelenik meg; az aktivitás 30%-a a 30%-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg; az aktivitás 60%-a az 50%-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg. Nagynyomású folyadék-kromatográfia Először a blau sepharose-oszlopról 50%-os etilénglikol-oldattal leoldott mintát vizsgáljuk. Ezután a blau sepharose-oszlopon kétszer kromatografált mintákat vizsgáljuk; ekkor mind a 30%-os, mind pedig az 50%-os etilén-glikol-oldattal kapott eluátumokat felhasználhatjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
