185382. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására
1 185 382 2 A nagynyomású folyadék-kromatográfiához oktilcsoportokkal módosított szilicium-dioxid-mátrixú adszorbenssel (Lichrosorb RP-8) töltött, 25X0,46 cm méretű oszlopot használunk fel. Az oszlopot először vízzel mossuk, majd felvisszük a blau sepharose-oszlopról távozó eluátumot. A szivattyú elé 5 ml térfogatú elegyítő kamrát helyezünk el. Az oszlopot 1 mól hangyasavat és 0,8 mól piridint tartalmazó oldattal (pH —4>2) eluáljuk, és az eluáló oldat n-propanol-tartalmát a következők szerint növeljük: 0% 10 perc; 30% 40 perc; 32% 40 perc. Végül az oszlopot 60%-os n-propanollal mossuk, és a következő felhasználás előtt 1 mólos hangyasawal és 0,08 mólos piridinnel egyensúlyba hozzuk. Az interferont a 32 % n-propanolt tartalmazó oldattal (a 80. és a 90. perc között) oldjuk le. A kapott termék a NaDodS04-akrilamíd gélen végzett elektroforézis eredményei alapján (Coomassie blau-vai végzett színezés, vagy a minta előzetes jelzése Fluram-mal) homogén. Négy különböző készítményből kilenc különböző mintát vettünk, és a mintákat 0,2% TGS-t tartalmazó 5,7 n sósavoldatban 24 órán át hidrolizáltuk. Ezután meghatároztuk az aminosav-tartalmat. Az átlagos aminosav-összetételt (22,0-ás leucin-értékre vonatkoztatva) az alábbiakban közöljük: Asx 15,1 ±0.7 Met 4,5 ±0,7 Thr* 7,0 ±0,5 Ile 9,4± 0,1 Ser* 7,5 ±0,5 Leu 22,0 Gly 22,2 ±0,5 Tyr 8,8 ±0,2 Pro n.h. Phe 8,0 ±0,3 Cys 3,0 ±0.3 Hb 4,5 ±0,1 Gly 6,92:0,7 Lys 11,0 ±0,6 Alá 7,4 ±0,0 Arg 11,9 ±0,7 Val 5,7 ±0,5 *korrigálatlan érték Trp n.h. A jelen és az előző példákban ismertetett különböző eljárásokkal kapott minták különböző időpontokban végzett elemzései alapián a homogén emberi fibroblaszt-interíeron aminosav-összetétele (±15%-os eltéréssel) a következő [a hidrolízist 24 órán át 0,2 % tiglikolsav (TGS) jelenlétében 6 n sósavoldattal végeztük] : Asx 15,1 Gly 6,9 Tyr 8,8 Thr* 7,0 Ala 7,4 Phe 8,0 Ser* 7,5 Val 5,7 His 4,5 G Sx 22,2 Met 4,5 Lys 11,0 Pro 3,0 Ile 9,4 Arg 11,9 Cys 3,9 T ** Leu 22,0 Trp 3,0 *koriigáiatlan érték ** vonatkoztatási érték 5. példa 1,5 mg homogén humán fibroblaszt-interferont [fajlagos aktivitás: 4X10® egység/mg] 25 ml 5%-os normál emberi szérumalbuminban oldunk. Az oldatot bakteriológiai szűrőn szűrjük, és aszeptikus körülmények között 100 ampullába töltjük. Minden egyes ampulla 6X106 egység tiszta interferont tartalmaz parenterális adagolásra alkalmas formában. Az ampullákat felhasználásig előnyösen hűtés közben (-20 °C-on) tároljuk. 8 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy szennyezett humán fibroblaszt-interferon-oldatot adszorbensként : concanavalin A-sepharoset, blau dexUán-sepharoset vagy blau sepharose 4B-t tartalmazó affinitás-kromatográfiás oszlopra viszünk fel, az oszlopon adszorbeált interferont foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat/etilén-glikol rendszerrel eluáljuk; a kapott tisztított frakciókat nagynyomású folyadék-kromatográfiás körülmények között egy vagy több, pufferrel egyensúlyba hozott, ciklohexil-, fenil-, difenil-, oktil-, oktadecil- vagy ciano-propilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrix-alapú kromatográfiás oszlopon rétegezzük és az oszlopon adszorbeált interferont kis szénatomszámú alkanolgrádiens - előnyösen három vagy négy szénatomos alkanol-grádiens - alkalmazásával, pufferolt, savas, vizes, 4-8 pH-jú rendszerrel eluáljuk. (Elsőbbség: 1980. március 14.) 2. Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy szennyezett humáh fibroblaszt-interferon-oldatot adszorbensként concanavalin A-sepharoset vagy blau dextrán-sepharoset tartalmazó affinitás-kromatográfiás oszlopra viszünk fel, az oszlopon adszorbeált interferont foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat/etilén-glikol rendszerrel eluáljuk; a kapott tisztított frakciókat nagynyomású folyadékkromatográfiás körülmények között egy vagy több, pufferrel egyensúlyba hozott, ciklohexil-, fenil-, oktil-, oktadecil- vagy ciano-propil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrix-alapú kromatográfiás oszlopon rétegezzük és az oszlopra adszorbeált interferont kis szénatomszámú alkanol-grádiens - előnyösen három vagy négy szénatomos alkanol-grádiens - alkalmazásával, pufferolt, savas, vizes, 4-8 pH-jú rendszerrel eluáljuk. (Elsőbbség: 1979. július 31.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az affinitás-kromatografálásnál concanavalin A-sepharoset alkalmazunk és a nagynyomású folyadék-kromatográfiát előbb ciklohexilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon, majd oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon végezzük el; és grádiens szerint növekvő mennyiségű n-butanolt tartalmazó piridin — hangyasav — 2-propanol - n-butanol - víz elegyeket alkalmazunk, rhol is az eluálószer kiindulási összetétele 8:8:20:0:64 térfogat/térfogat rész és végső összetétele 8:8:25:20:39 térfogat/térfogat rész. (Elsőbbség: 1979. július 31.) 4. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az affinitás-kromatografálásnál blau dextrán-sepharoset alkalmazunk és a nagynyomású folyadék-kromatografálást oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon, grádiens szerint növekvő mennyiségű n-butanolt tartalmazó piridin - hangyasav - 2-propanol — n-butanol - víz elegyekkel végezzük el, ahol is az eluálószer kiindulási összetétele 8:8:20:3,3:60,7 térfogat/térfogat rész vagy 8: 8:20:0:64 térfogat/térfogat rész és végső összetétele 8:8:25:20:39 térfogat/térfogat rész. (Elsőbbség: 1979. július 31.) 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az affinitás-kromato-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
