185382. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására
1 185 382 2 therapy 2, 476- 484 (1972) fibroblaszt interferontartalom: 19 400 egység/ml] 0,3 ß pórusméretű szűrőn szűrünk, majd a szűrletet 275 ml blau dextrán-sepharose adszorbenssel töltött oszlopra visszük fel. A szűrlethez előzetesen 1,25 mólos nátrium-klorid-koncentráció eléréséig 1350 ml telített vizes nátrium klorid-oldatot (6,3 mól) adunk. Az oldatot 360 ml/óra átfolyási sebességgel szivattyúzzunk az oszlopra. Az interferon körülbelül 4-6 %-a adszorbeálódás nélkül áthalad az oszlopon. (b) Ezután az oszlopot 420 ml/óra átfolyási sebességgel 1300 ml vizes oldattal mossuk, amely 15 térfogat % etilénglikolt, 1 mól nátrium-kloridot és 0,02 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) tartalmaz. Az adszorbeált interferon körülbelül 1 %-át a mosás során leoldjuk az oszlopról. (c) Ezután az interferont 50 térfogat % etilénglikolt, 1 mól nátrium-kloridot és 0,02 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) tartalmazó vizes oldattal 420 ml/óra átfolyási sebességgel eluáljuk. Az eluátum első 200 ml-es frakciója csak kevés interferont tartalmaz. Miként az alábbi táblázat adataiból megállapítható, az interferon fő tömege a következő - összesen 300 ml térfogatú - eluátumfrakciókban dúsul fel. Frakció száma Frakció térfogata, ml Fehérje Mg/ml Interferon faktor egység/ml Fajlagos aktivitás egység/mg 1. 200 n.h. 122 2. 50 43 3,8X10® 9,02X10® 3. 50 82 11.64X105 1,42X107 4. 50 64 7,72X 10s 1,23 X107 5. 50 62 1,94X10S 3,13X10® 6, 50 49 9,7X104 1,97X10® 7. 50 41 3.64X104 8,87X105 A bemért interferon-aktivitás összesen 114 %-át nyertük vissza. Nagynyomású folyadék-kromatográfia A blau dextrán-sepharose oszlopról elkülönített 2-6. frakciót [250 ml; 13X107 egység, fajlagos aktivitás: 8,12X106 egység/mgj 4 ml/perc átfolyási sebességgel egy 9,5X500 mm méretű, oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbens-oszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopon 12 perc alatt 2 ml/perc átfolyási sebességgel „A” pufferoldatot (piridin, hangyasav, 2-propanol, n-butanol és víz 8:8:20:2,5:61,5 térfogatarányú elegye) szivattyúzunk keresztül. Ezután az eluálást 1,25 ml/perc átfolyási sebességgel folytatjuk, az „A” pufferoldattól a ,,B” pufferoldat (piridin, hangyasav, 1-propanol, n-butanol és víz 8:8:25:25:34 térfogatarányú elegye) felé haladva folytatjuk, a következők szerint: 0-20% „B” 18 perc; 20-29% „B” 57 perc; 29% „B” (izokratikus) 27 percen keresztül; 29-30% „B” 3 perc, 30-100% „3” 36 perc; 100% „B” 54 perc. Az interferon-aktivitás a grádienselúció izokratikus tartományában dúsul fel egyetlen csúccsal, amit fluoreszcamin monitor-rendszerrel mutattunk ki. Az 50 ml-es frakció 45X106 egység (hozam: 35 %) interferont tartalmaz, amelynek fajlagos aktivitása 2X108 egység/mg. 6 A terméket zárt polipropilén-ampullákban 2 hónapon át —20 °C-on tárolva az aktivitás a nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépés után mért érték 10%-ára esik vissza, a fehérjetartalom azonban nem csökken. A fentiek szerint kapott 50 ml térfogatú frakciót [fajlagos aktivitás: körülbelül 0,2X10® egység/mg] 1 ml tiodiglikollal és 20 ml n-propanollal keverjük össze. A kapott elegy aktivitása - aktivitás vizsgálattal meghatározva - összesen 4,26X10® egység. Az elegyhez 100 ml 0,1% Triton X-100) 0,3% tiodiglikol elegyet adunk, majd a kapott elegyet (amelynek aktivitás vizsgálattal meghatározott interferon-tartalma összesen 5,1X106 egység), 30 perc alatt, 1,5 ml/óra átfolyási sebességgel átszivattyúzzuk egy ciano-propil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbenssel (5 ßl8X10-® mm, Spherisorb) töltött, 4,6X250 mm méretű oszlopon. Az interferon felvitele előtt az oszlopot „A” pufferoldattal (piridin, hangyasav és víz 8:8:84 térfogatarányú elegye) hozzuk egyensúlyba. Ezután az oszlopot 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel grádienselúciónak vetjük alá, az „A” pufferoldattól a „B” pufferoldat (piridin, hangyasav, n-propanol és víz 8 :8 :50:34 térfogatarányú elegye) felé haladva, a következők szerint: 0-25% „B” 30 perc; 25-50% „B” 210 perc. Az x interferon-aktivitás az egyetlen meghatározott csúcsban jelenik meg. Három, egyenként 1 ml-es frakcióban 4,2X 10® egység (82%) interferont nyerünk vissza. Ezt az egyesített frakciót, amely az első cianocsoportokat tartalmazó oszlopra felvitt összfehérje 69%-ának felel meg, 2 ml 0,1 %-os Triton X-100 oldattal elegyítjük, és az elegyet ismét átbocsátjuk ugyanazon a ciano-csoportokat tartalmazó oszlopon. A grádienseiúciót ugyanolyan arányokkal, azonban csak az előzőekben megadott idő feléig végezzük. A teljes aktivitás (11,75X10® egység; hozam 280%), egyetlen csúcsban jelenik meg. A második ciano-csoportokat tartalmazó oszlopról leoldott, interferon-'aktivitást mutató, összesen 4 ml térfogatú frakciót 1,5 ml/perc átfolyási sebességgel egy difenil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbenssel töltött, 4,6X250 mm méretű oszlopon szivattyúzzuk át. Az adszorbenst előzetesen két órás lineáris grádienskezeléssel az „A” pufferoldattól a „B” pufferoldat felé haladva előkezeljük, majd az „A” pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. Az „A” és a „B” pufferoldat összetétele azonos a ciano-csoportokat tartalmazó oszlop eluálásakor alkalmazottakkal. Az adszorbens-oszlopot az „A” pufferoldattól a „B” pufferoldat felé haladva 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel grádienselúciónak vetjük alá a következők szerint: 0-25% „B” 22 perc; 25-50% „B” 98 perc. A második csúcs, amit akkor oldunk le, amikor a grádiensmérő műszer 33 %-os „B” pufferoldat-tartalmat jelez, megegyezik az interferon-aktivitási csúccsal. Ez a csúcs összesen 2,6X10® egység (22%) aktivitást és 40 ßg fehérjét tartalmaz. A difenil-csoportokat hordozó szilícium-dioxid-oszlopot a következőképpen állítjuk elő: 10-2 ram szemcseméretű, 10-5 mm pórusméretű szilíciumdioxidot TO : 1 térfogat/súlyarányban 6 N sósavoldatban áztatunk 24 órán át, időnkénti rázogatás közben. Ezután a szilíciumdioxidot vízzel semlegesre mossuk, majd acetonnal és metanollal végzett mosással eltávolítjuk a vizet. A szilicium-dioxidot éjszakán át csökkentett nyomáson szárítjuk, majd 1 g így kapott anyagot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
