185382. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására
1 185 382 2 penziót éjszakán át 4 °C-on, gömblombikban rázzuk. A szilárd anyagot 10 térfogatrész 1 mólos nátriumklorid-oldattal és 2 térfogatrész, 1 mól nátrium-kloridot és 0,05 mól nátrium-foszfátot tartalmazó 50 térfogat %-os etilén-glikollal (pH = 7,2) ■ mossuk, éjszakán át 50 térfogat %-os etilén-glikolban állni hagyjuk, majd egy térfogatrész 80 térfogat %-os etilén-glikollal és 5 térfogatrész Gibco No. 11 minimális közeggel (MÉM) mossuk, (kereskedelmi forgalomban lévő termék; gyártó cég; Gibco Laboratories) és ebben a közegben éjszakán át 50 °C-on tartjuk. A gyantát ismét 3 térfogatrész, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó 80 térfogat %-os vizes etilénglikollal, végül 2 térfogatrész MEM-mel mossuk, majd MEM-ben szuszpendáljuk és oszlopba töltjük. Affinitás-kromatográfia 35 ml blau dextrán-sepharose 4B gyantát tartalmazó, porózus polietilén-lemezzel ellátott, 50 ml térfogatú polipropilén-oszlopon lOOml/óra (20 cm/óra) átfolyási sebességgel 1,5 liter nyers emberi fibroblaszt-interferon oldat [2X104 egység/ml, 1 mg fehérje/ml; fajlagos aktivitás: 2X104 egység/mg fehérje] és 0,27 térfogatrész telített vizes nátrium-klorid-oldat (körülbelül 6,3 mól nátriumklorid) elegyét bocsátjuk át. Az oszlopot egymás után 200 ml, 0,05 mól nátrium-foszfát-puffert (pH = 7,2) tartalmazó 1 mólos nátrium-klorid-oldattal és 500 ml, 0,05 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) és 75 ml etilénglikolt tartalmazó 1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, végül 500 ml, 0,05 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) és 250 ml etilénglikolt tartalmazó 1 mólos nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az interferont körülbelül 90 %-át egyetlen csúcsban eluáljuk az áttört, 50 % etilén-glikolt tartalmazó, oldószerrel együtt. A csúcs maximumának fajlagos aktivitása, amellyel az összes interferon több mint 50%-át eluáltuk, IX107 egység/mg. Nagynyomású folyadék-kromatográfia A) 1 mólos nátrium-klorid-oldat és 50 térfogat % etilénglikol elegyével előzetesen egyensúlyba hozott, 4,6X300 mm méretű oszlopba töltött, oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbensen (Chromegabond 10 fi) 125 ml, a blau dextrán-sepharose 4B oszlopról elkülönített interferonoldatot [3X107 egység; fajlagos aktivitás: IX107 egység/mg] bocsátunk át. 0.45 ml/perc átfolyási sebesség esetén az oszlopot „A” pufferoldatból (piridin, hangyasav, izopropanol, n-butanol és víz 8:8:20:3,3:60,7 térfogatarányú elegye) kiindulva és a „B” pufferoldat (piridin, hangyasav, izopropanol, n-butanol és víz 8:8:25:70:39 térfogatarányú elegye) felé haladva a következő grádiens szerint eluáljuk: 0-25 % „B” 30 perc; 25-55 % „B”, 190 perc; 55-100% „B”, 20 perc; 100% ,,B”, 60 perc. A 18-23. frakcióban az interferon-aktivitás lényegében egyetlen fehéije-csúcsnak felel meg (mindegyik frakció 1,5 ml eluáló folyadékot tartalmaz). (B) Az (A) pontban felhasznált anyagmennyiség körülbelül egynegyedét visszük fel az (A) pontban ismertetett oszlopra, és az oszlopot az 1. példában, a ciklohexilcsoportokat tartalmazó oszlopnál ismertetett körülmények között eluáljuk. A 24-26. frakcióban az interferon-aktivitás egyetlen fehérje-csúcsnak felel meg. (C) A kromatografálást az (A) pontban ismertetett anyagmennyiséggel, átfolyási sebességgel és grádienssel végezzük, a (B) pontban felhasznált „A” és „B” pufferoldatot alkalmazzuk, adszorbensként pedig oktilcsoportokat tartalmazó, 9,6X500 mm méretű oszlopot (Chromegabond) használunk [a felvitt anyagmennyiség és az oszloptérfogat aránya 1/9]. Az előzőeknél jobb minőségű elválasztást érünk el. (D) Az (A) pontban ismertetett eljárással kapott, legnagyobb fajlagos aktivitású [4X108 egység/mg] anyagot ciano-propil-csoportokat tartalmazó oszlopon újra kromatografáljuk. Eluálószerként kezdetben piridin, hangyasav és víz 8 :8:84 térfogatarányú elegyét használj uk, és az eluálószerben a n-propanol részarányát egy óra alatt, grádieiis szerint 0-ról 40 térfogat %-ra növeljük. Az átfolyási sebességet 0,3 ml/percre állítjuk be. Szimmetrikus főcsúcsot kapunk. Elekiroforézis NaDodSO4 - poliakrilamid gélen Az (A), (B) és (C) pontban ismertetett eljárással kapott interferon mintáit az 1. példában ismertetett módon gél-elektroforézisnek vetettük alá. 20 500-as molekulasúlyú anyagból álló főcsúcsot kaptunk, amely egybeesik az interferon-aktivitás vizsgálatban meghatározott aktivitási csúcs közepével. Mintáról mintára változó mennyiségben egy másik, körülbelül 10 500-as molekulasúlyú anyagnak megfelelő csúcsot is észleltünk, amely — az elszíneződés intenzitása alapján — a teljes anyagmennyiség körülbelül 20—50%-ának felelt meg, és vírusellenes aktivitást nem mutatott. Azokban a kísérletekben, amikor a mintákat nem kezeltük merkapto-etanollal, egy 40 000-es molekulasúlyú sávot is észleltünk, amely azonban csak alárendelt mértékű aktivitással rendelkezett. A 20 000-es és 40 000-es molekulasúlyú sávok aminosav-elemzésének eredményei nem tértek el egymástól, míg a 10 000-es molekulasúlyú sáv aminosav-elemzésének eredményei jelentősen eltértek az előzőektől. A (D) pont szerint kapott interferon mintájának molekulasúlya - az elektroforézis eredményei alapján — kb. 20 500, fajlagos aktivitása pedig 4X108 egység/mg volt. Ezt a homogén pepiidet 24 órán át 6 n sósav-oldatban hidrolizáltuk, majd meghatároztuk az aminosavak mennyiségét. Az észlelt eredményeket - leucinra vonatkoztatva és a leucint 25,0-nak tekintve - az alábbiakban soroljuk fel: Asx 15,4 ±0,2 Alá 11,8 ±0,4 Tyr 9,6 ±0,2 Thr* 7,8 ±0,3 Cys n.h. Phe 7,3 ±0,1 Ser* 7,7 ±0,2 Val 6,9 ±0,1 His 4,5 ±0,1 Glx 24,1 ±0,4 Met 2,8 ± 0,4-Lys 11,6 ±0,4 Pro 2,8 ±0,4 Ile 8,7 ± 0,1 Arg 8,8 ±0,4 Gly 4,9 ±0,3 Leu 25,0 Trp n.h. * = korrigált érték n.h. = nem határoztuk meg 3. példa Affinitás-kromatográfia blau dextrán-sepharose adszorbensen (a) 5 liter tenyészetet [előállítása Havell és Vilcek módszerével történik: Antimicrobial Agents and Chemo-5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
