185382. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására
1 185 382 2 A találmány tárgya új eljárás humán fibroblaszt-interferon előállítására homogén fehérje formájában, affinitás-kromatográfia és nagynyomású folyadék-kromatográfia (HPLC) kombinálásával. Az interferon felfedezése (Isaacs és Lindenmann, 1957) óta eltelt két évtized alatt a világszerte folyó intenzív kutatómunka ellenére sem leukocytákból, sem fibroblasztokból (fibrocytákból) nem sikerült az interferont a termék jellemzését és specifikus biológiai és kémiai tulajdonságainak meghatározását lehetővé tevő mennyiségben homogén pepiid formájában elkülöníteni. Néhány szerző ugyan azt közölte, hogy sikerült egérinterferont vagy emberi interferont a teljes homogenitás eléréséig tisztítania; a fehérjék homogenitását bizonyító klasszikus adatokat azonban nem közöltek, és az állítólagosán tiszta vegyületek tulajdonságait sem ismertették. A nagynyomású folyadék-kromatográfia a fehérjék tisztításának általánosan ismert módszere. A szakirodalomban a fehérjék tisztítására elsősorban ioncserés és kiszorításos oszlopkromatográfiás eljárásokat ismertettek [lásd például Regnier és Noel: J. Chromatogr, Sei. 14, 316 (1976) és Chang és .munkatársai: Anal. Biochem. 48, 1839 (1976)]. A fordított fázisú (inverz) kromatográfiában a peptidek (így a (3-endorfin) tisztítására sikerrel alkalmaztak például Lichrosorb RP-18-at [oktadecillel módosított szilícium-dioxiddal töltött oszlopok; lásd például Rubinstein és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 4969-4972 (1977)]. Ismert az is. hogy az emberi fibroblaszt-interferon tisztítására affinitás-kromatográfiás módszerek is felhasználhatók. így például Davey és munkatársai [J. Bioi. Chem. 251. 7620 0 976)] concanavalin A-sepharose 4B alkalmazását ismertették tisztított emberi fibroblasztinterferon előállítására. Jankowski és munkatársai (Biochemistry 15, 5182 (1976)] ugyanerre a célra blau dextrán-sepharose abszorbenst használtak fel. Végül a 4 172 071 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (de Maeyer és munkatársai) szerint a különböző nyers leukoeyta- és. fibroblaszt-interferonok oldatait affinitás-kromatográfiás módszerrel, blau dextránsepharose oszlopon tisztítják, és így 1-5X108 nemzetközi interferon-egységnek megfelelő fajlagos aktivitású készítményekéi állítanak elő. További tisztítási lépéseket nem ismertettek. Minthogy a kapott interferon-készítmények még igen nagy mennyiségben tartalmaznak interferon-analóg aktivitással rendelkező termékeket, szükség van arra, hogy legalább a szennyező fehérjék nagy részét eitávolítsuk az interferon-készítményekből. A találmány tárgya javított eljárás emberi fibroblasztinterferon előállítására homogén fehérje formájában, affinitás-kromatográfia és nagynyomású folyadék-kromatográfia kombinációjával. A találmány értelmében a következőképpen járunk el: 1) Szennyezett emberi fibroblaszt-interferon vizes oldatát affinitás-kromatográfiai oszlopra visszük fel, az oszlopon adszorbeáltatjuk az interferont, az interferont leoldjuk az oszlopról, és a nagyobb tisztasági fokú interferont tartalmazó eluátumfrakciókat összegyűjtjük; és 2) a kapott interferon-frakciókat a nagynyomású folyadék-kromatográfia körülményei között egy vagy több, pufferoldattal egyensúlyba hozott, ciklohexil-, fenil-, difenil-, oktil-, oktadecil- vagy ciano-propil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú kromatográfiás oszlopon bocsátjuk át, az oszlopon adszorbeáltatjuk az interferont, majd grádiens szerint változó 2 mennyiségű vízzel elegyedő szerves oldószereket tartalmazó, pufferolt savas vizes rendszerrel leoldjuk az interferont úgy, hogy az interferon az eluátum meghatározott frakcióiban egyetlen éles csúcs formájában jelenik meg. Találmányunk tárgya eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására oly módon, hogy szennyezett humán fibroblaszt-interferon-oldatot adszorbensként concanavalin A-sepharoset, blau dextrán-sepharoset vagy blau sepharose 4B-t tartalmazó affinitás-kromatográfiás oszlopra viszünk fel, az oszlopon adszorbeált interferont foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat/etilén-glikol rendszerrel eluáljuk; a kapott tisztított frakciókat nagynyomású folyadék-kromatográfiás körülmények között egy vagy több, pufferrel egyensúlyba hozott ciklohexil-, fenil-, difenil-, oktil-, oktadecil- vagy cianopropil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixalapú kromatográfiás oszlopon rétegezzük és az oszlopon adszorbeált interferont kis szénatomszámú alkanolgrádiens - előnyösen három vagy négy szénatomos alkanol-grádiens - alkalmazásával, pufferolt, savas (pH = 4-8) vizes rendszerrel eluáljuk. A találmány szerinti eljárás affinitás-kromatográfiás lépésében concanavalin A-sepharose-t vagy blau dextránsepharose-t vagy blau sepharose 4B-t használhatunk fel. Ezek kereskedelmi forgalomban lévő termékek (gyártó cég: Firma Pharmacia). Előnyösen az utóbbi adszorbenst alkalmazzuk, mert ekkor az interferont lényegesen nagyobb kitermeléssel, stabilabb végtermék formájában kapjuk. Ha az affinitás-kromatográfiás lépésben concanavalin A-sepharose 4B-t használunk fel, a kromatografálást a következőképpen végezhetjük: ( 1 ) Concanavalin A-sepharose 4B oszlopra az oszlop térfogatának 20—30-szorosát kitevő mennyiségű, 5% borjúembrió-szérumot tartalmazó Eagle-féle minimális tápközeggel készített nyers emberi fibroblaszt-oldatot (fajlagos aktivitás: körülbelül 104 egység/mg) szivattyúzunk 30-60 cm/óra átfolyási sebességgel; (2) az oszlopot 7,2 pH-értékű, foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal (PPK) mossuk; (3) az oszlopot 0,1 mól a-metil-mannozidot (ot-MM) tartalmazó PPK-oldattal mossuk; és (4) az oszlopot 50 térfogati etilén-glikolt tartalmazó PPK-0,1 mólos a-MM oldattal eluáljuk. A (4) lépésben kapott tisztított interferon fajlagos aktivitása körülbelül 107 egység/mg, hozama pedig körülbelül 10-30%. Ha az affinitás-kromatográfiás lépésben blau dextránsepharose adszorbenst használunk fel, a kromatografálást a következőképpen végezhetjük: (1) az oszlop térfogatának 10-40-szeresét kitevő mennyiségű tenyészethez (1-3X104 egység/ml, 0,2-1 mg fehérje/ml) 1,25 mól nátrium-klor'id-tartalom eléréséig telített nátrium-klorid-oldatot adunk, és az elegyet 20-40 cm/óra lineáris átfolyási sebességgel az oszlopra szivattyúzzuk, (2) az oszlopot az oszlop térfogatának 5-15-szörösét kitevő mennyiségű 1 mólos NaCl/0,02-0,05 mólos foszfát-puffer-oldattal, majd az oszlop térfogatának 5-15-szörösét kitevő mennyiségű, 15 térfogat % etilénglikolt tartalmazó 1 mólos NaCl/0,02-0,05 mólos foszfát-puffer-oldattal (pH = 7,2) mossuk, és (3) az interferont 50 térfogat % etilén-glikolt tartalmazó 1 mólos NaCl/0,02-0,0‘5 mólos foszfát-pufferoldattal (pH = 7,2) eluáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
