185382. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására
1 185 382 2 À kapott interferon fajlagos aktivitása körülbelül 3X106 egység/mg. Ebben a lépésben az interferont körülbelül 80%-os hozammal kapjuk. Az affinitás-kromatográfiás lépésben felhasznált blau dextrán-sepharose adszorbenst úgy állíthatjuk elő, hogy brómciánnal (CNBr) aktivált sepharose 4B-t 9,5-es pH- értéken blau dextránnal (Cibracon blau F3GA-val kapcsolt dextránnal) kapcsolunk. A kapcsolási eljárásnak — a gyanta mosásához és érleléséhez, valamint az oszlop feltöltéséhez és eluálásához hasonlóan — döntő szerepe van abban, hogy az emberi fibroblaszt-interferont maximális hozammal, rendkívül tiszta állapotban különítsük el. Ha szérummentes közegből származó interferont használunk fel, az interferont úgy tisztítjuk, hogy az interferont blau sepharose-4B oszlopon egyszer vagy kétszer átbocsátjuk, és az oszlopot 30-50 térfogati etilén-glikolt tartalmazó pufferolt vizes oldattal (pH = = 7,2) eluáljuk. Az interferon további tisztítása céljából az affinitáskróm atográfia után kapott terméket egy vagy több lépésben nagy felbontóképességű, nagy hozamot biztosító nagynyomású folyadék-kromatográfiának vetjük alá. A nagynyomású folyadék-kromatográfiíhoz porózus szilícium-dioxid mátrix alapú oszlopokat használunk fel, ahol a mátrixhoz ciklohexil-, oktil-, oktadecil-, fenil-, difenil- vagy ciano-propil-csoportok kapcsolódnak. Ezeken az oszlopokon (amelyeket egymás után kapcsolva használhatunk fel, és a grádienselúciót oszloponként eltérő pH-értékeken, valamint oszloponként eltérő mennyiségű szerves oldószert tartalmazó eluálószerrel végezhetjük) a humán fibroblaszt-interferont homogenitásig tisztíthatjuk. Az interferont akkor tekinthetjük homogénnek, ha nátrium-dodecil-szulfát (NaDodS04)poliakrilamid gél-elektroforézisben egyetlen sávot ad, állandó fajlagos aktivitással rendelkezik, és.nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálatban egyetlen csúcsot ad, egymással összhangban lévő aktivitási és fehérjesávokkal. A ciklohexil-, oktil-, oktadecil-, fenil- vagy cianopropil-csoportokat tartalmazó, szabálytalan alakú, teljes mértékben porózus szilícium-dioxid-mátrix (szemcseméret: körülbelül 10 p; pórusméret: körülbelül 10~s mm) alapú kromatográfiás oszlopok kereskedelemben beszerezhető termékek. A találmány céljaira alkalmas nagynyomású folyadék-kromatográfiás rendszert ismertet többek között a 4 116 046 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Stanley Stein). A találmány szerinti eljárás értelmében az affinitáskromatográfiával tisztított emberi fibroblaszt-interferonoldatot 4 és 8 közötti pH-értékű vizes pufferoldatban bocsátjuk át a szilíciumdioxid-oszlopon. Erre a célra pufferoldatként előnyösen használhatjuk fel piridin, hangyasav és víz 8 :8 :84 térfogatarányú elegyét. A kromatografálást előnyösen 344 505 és 34 450 500 Pa közötti nyomás-tartományban végezzük. Az oszlopon megkötött interferont ezután szelektíven leoldjuk az oszlopról; eluálószerként vizes pufferoldatot használunk, amely gradiens szerint változó mennyiségben tartalmaz vízzel elegyedő szerves oldószert. Vízzel elegyedő szerves oldószerekként mindenekelőtt alkanolokat, így n-propanolt, izopropanolt, n-butanolt, tercbutanolt, etanolt és metanolt alkalmazhatunk. A humán fibroblaszt-interferon eluálására különösen előnyösnek bizonyult a propanol és butanol elegye. Az eluátumot szokásos módon bontjuk frakciókra, és nagy érzékenységű módszerrel folyamatosan regisztráljuk az egyes frakciók fehérje-tartalmát. Erre a célra például a Bohlen és munkatársai {Anal. Biochem. 67, 438 (1975)] által ismertetett rendszert alkalmazhatjuk (lásd még a 3 876 881 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást). A nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépésben legelőnyösebben felhasználható gyanták jellege a tisztítandó emberi fibroblaszt-interferon eredetétől és tisztaságától függően változik. A concanavalin A-sepharose oszlopról elkülönített anyagot a nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépésben célszerűen ciklohexil-csoportokkal módosított szilícium-dioxid-oszlopon, majd oktilcsoportokkal módosított szilícium-dioxid-oszlopon tisztítjuk a homogenitás eléréséig. A blau dextrán-oszlopról származó anyagokat ezzel szemben egy vagy több lépésben egy oktilcsoportokkal módosított szilícium-dioxid-oszlopon vagy egy oktilcsoportokkal módosított, valamint egy ciano-propilcsoportokkal módosított szilícium-dioxid-oszlopon bocsátjuk át, végül szükség esetén egy difenil-csoportokkal módosított szilícium-dioxid-oszlopon tisztítjuk a homogenitás eléréséig. Abban az esetben, ha szérummentes preparátumból származó interferonból indulunk ki, és az affinitás-kromatográfiai lépésben blau sepharose-4B oszlopot alkalmazunk, a teljes homogenitás eléréséhez elegendő, ha a nagynyomású folyadékkromatográfiás lépésben a tisztítandó anyagot egyetlen alkalommal egy oktilcsoportokkal módosított szilíciumdioxid-oszlopon bocsátjuk át. Tekintettel arra, hogy a humán fibroblaszt-interferon semleges pH-értékeken szerves oldószerekre, így propanolokra, butanolra vagy 2-metoxi-etanolra érzékeny, a kromatografálást savas pH-értékeken végezzük. Minthogy a humán fibroblaszt-interferon a leukocita-interferonnál nagyobb mértékben hidrofób, és a részlegesen tisztított fibroblaszt-interferon preparátumok további, nagyobb mértékben hidrofób fehérjéket is tartalmaznak, a nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépésben alkalmazott fordított fázison a propanol és butanol elegyét tartalmazó eluálószerek bizonyultak a legjobbnak. Propanol és butanol elegyének alkalmazásakor korlátozhatjuk az eluálószer szerves oldószer-tartalmát, és így csökkenthetjük az eluátumban megjelenő idegen adalék (szerves oldószer) mennyiségét. A találmány szerinti eljárással kapott homogén humán fibroblaszt-interferont a mindenkori utolsó nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopon végzett átvezetés után egyetlen csúcsot adó anyag formájában különítjük el. A kapott tennék 2-merkapto-etanol jelenlétében végzett nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél-elektroforézis során egyetlen szűk sávot ad. A gél extrakciójakor egyetlen vírusellenes aktivitással rendelkező csúcsot kapunk, ami megfelel a fehérje-sávoknak. Erre a célra az emberi fibroblaszt-interferon aktivitásának meghatározására alkalmas bármilyen ismert vizsgálati módszert felhasználhatunk. A homogén emberi fibroblaszt-interferon molekulasúlya (poüakrilamid gél-elektroforézis alapján meghatározva) 20 500 körüli érték. A tisztított anyag fajlagos aktivitása körülbelül 4X108 egység/mg. A homogén humán fibroblaszt-interferon mintájának vizsgálata során a következő (az. N-terminális oldalról kiinduló) aminosav-részszekvenciát határoztuk meg: 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
