185379. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új luteotróp releasing faktor monapeptid és dekapeptid származékainak előállítására
1 185 379 2 védett) aminosavat hozzáadjuk, majd a továbbiakban is hasonlóképpen járunk el. Miután az összes aminosavat a kívánt sorrendben összekapcsoltuk, a védőcsoportokat (és a szilárd hordozót) egymás után vagy egyidejűleg eltávolítjuk. E módszert egyszerűen úgy módosíthatjuk, hogy a növekvő peptidlánchoz egyszerre több aminosavat adunk, pl. egy védett tripeptidet egy védett dipeptiddel kapcsolunk (olyan körülmények között, hogy a királis centrumok ne racemizálódjanak) és így, a védőcsoportok eltávolítása után már pentapeptidet kapunk. 10 A találmány szerinti vegyületek esetén különösen előnyösen alkalmazhatjuk a szilárd fázisú peptidszintéziseket. A módszer során az aminosavak a-aminocsoportját savra vagy bázisra érzékeny védőcsoporttal védjük. 15 E védőcsoportok egyrészt a peptidkapcsolás körülményei között stabilisak kell. hogy legyenek, másrészt - az épülő peptidlánc hasadása, és a királis centrumok racemizálódása nélkül - könnyen eltávolít hat ók kell, hogy legyenek. Megfelelő védőcsoportok a következők 20 lehetnek: t-butiloxi-karbonil-(Boc), benziloxi-karbonil-(Cbz), bifenil-izopropiloxi-karbonil-, t-amiloxi-karbonil-, izoborniloxi-karbonil-, a,a-dimetil-3,5-dimetoxi-benziloxikarbonil-, o-nitro-fenil-szulfenil-, 2-ciano-t-butiIoxi- 25 karbonil-, 9 fluorenil-metiloxi-karbonil- és más hasonlók; előnyösen t-butiloxi-karbonil-csoport (Boc).. Különösen előnyös védőcsoportok arginin esetén: nitro-, p-toluol-szulfonil-, 4-metoxi-benzol-szulfonil-, Cbz, Boc és adamantiloxi-karbonil-, lirozin esetén: 30 benzil-, o-bróm-benziloxi-karbonil-, 2,6-diklór-benzil-, izopropil-, ciklohexil-, ciklopentil- vagy acetil-, szerin esetén: benzil- vagy tetrahidropiranil-; hisztidin esetén: benzil-, p-toluol-szulfonil- vagy 2,4-dinitrofenil-csoport. A C-terminális aminosavat megfelelő szilárd hordozó- 35 hoz kötjük, Szilárd hordozóként azok megfelelőek, amelyek a reagensek és reakciókörülmények szempontjából inertek (a kondenzációban és a védőcsoportok eltávolítása során), valamint a reakcióközegben oldhatatlanok, pl. klórmetil-polisztirol-divinil-benzol polimer, 40 hidroximetil-polisztirol-divinil-benzol polimer és más hasonló, előnyösen klórmetil-polisztirol 1% divinilbenzol polimer megfelelőek. H a C-terminális glicinamid, akkor előnyösen benzhidrilamino-polisztirol-divinil-benzol polimert használunk, melyet P. Rivaille és 45 munkatársai írtak le [Helv.Chim. Acta,54, 2772 (1971)]. A klórmetil-polisztirol-divinil-benzol' típusú gyantához való hozzákapcsolást oly módon végezzük, hogy a védett N“-aminosav, előnyösen BOC-aminosav, cézium-, tetrametil-ammónium, trietil-ammónium, 4,5-diazabi- 50 ciklo[5.4.0]undec-5-én vagy hasonló sóját etanolban, acetonitrilbén vagy N,N-dimetilformamidban (DMF-ben) és más hasonló oldószerben - előnyösen a cézium sót DMF-ben — magasabb hőmérsékleten, pl. kb. 40 és 60 °C közötti, előnyösen kb. 50 °C hőmérsékleten kb. 55 12-48 órán át, előnyösen 24 órán át kezeljük a klórmetil gyantával. Az N“-BOC-aminosavat a benzhidrilamin típusú gyantához N,N'-diciklohexilkarbodiimid (DCC) és 1-hidroxi-benztriazol (HBT) segítségével, kb. 2-24 óra, előnyösen 12 óra alatt, kb. 10 és 50 °C közötti előnyösen 25 °C hőmérsékleten, diklór-metánban vagy DMF-ben előnyösen diklór-metánban kapcsoljuk. A következő védett aminosavakat a peptidkémiában jól ismert automatikus polipeptid szintetizálóval építhetjük be. Az N“-védőcsoportokat pl. trifluor-ecetsav 55 metilén-kloriddal, hidrogén-klorid dioxánnal, vagy liidrogén-klorid ecetsavval készített oldatával, vagy más erős sav oldatával, előnyösen trifluor-ecetsav metilén-kloriddal készített 50%-os oldatával, közönséges hőmérsék- 5 létén távolíthatjuk el. Valamennyi aminosavat kb. 2,5- szeres moláris feleslegben használjuk, és a kapcsolási reakciót diklór-metánban, diklór-metán és DMF elegyekben, DMF-ben és más hasonló oldószerben, előnyösen metilén-kloridban, közönséges hőmérsékleten végezzük. Kapcsoló ágensként rendszerint DCC-t használunk, diklór-metánban, de N,N'-diizopropilkarbodiimidet vagy egyéb karbodiimidet, adott esetben HBT N-hidroxiszulcinimid vagy más N-hidroxi-imid vagy oxim jelenlétében is használhatunk. További lehetőség, hogy a reakcióban a védett aminosavak aktív észtereit (pl. p-nitro-fenil, pentafluor-fenil vagy más hasonló észtereket) vagy szimmetrikus anhidridjei! használjuk. A szilárd fázisú szintézis végén a teljesen védett polipeptidet eltávolítjuk a gyantáról. Ha a gyantához való kötés benzil-észter típusú, úgy C-terminálisként prolint tartalmazó peptidek esetén — a hasítást alkil-aminnal vagy fluor-alkil-aminnal végzett aminolízissel, C-termináliskónt glicint tartalmazó peptidek esetén ammónia metarolos vagy ammónia etanolos oldatával végzett aminolízissel kb. 10 és 50 °C közötti előnyösen kb. 25 °C hőmérsékleten, kb. 12—24 óra, előnyösen kb. 18 óra alatt hajtjuk végre. Egy másik lehetőség, hogy a pepiidet pl. metanollal végzett átészteresítést követő aminolízissel távolítjuk el a gyantáról. A védett pepiidet ezután szilikagélen végzett kromatográfiával tisztíthatjuk. A polipeptid (oldallánc) védőcsoportjait oly módon távolíthatjuk el, hogy az aminolízissel kapott terméket pl. an zol vagy más derítő jelenlétében vízmentes cseppfolyós hidrogén-fluoriddal, vagy hidrogén-fluorid/piridin komplexszel vagy írisz (trifluor-acetil)-bórral és trifluorecctsavval vagy hidrogénnel csontszenes palládium katalizátor vagy polivinilpirrolidon jelenlétében vagy nátriummal cseppfolyós ammóniában, előnyösen cseppfolyós hidrogén-fluoriddal anizol jelenlétében, kb. -10 és +10 °C közötti, előnyösen kb. 0 °C hőmérsékleten, kb. 15 perc — 1 órán át, előnyösen kb. 30 percen át kezeljük. A benzihidriiamin típusú gyantákhoz kötött glicin-terminális peptidek esetén a gyantához való kötés hasítását és védőcsoportok eltávolítását a fentiekben ismertetett módon cseppfolyós hidrogén-fluoriddal és anizollal egy lépésben végezhetjük. A védőcsoportok eltávolítása után a polipeptidet a következő kromatográfiás módszerek bármelyike, adott esetben valamennyi egymás utáni alkalmazásával tisztítjuk: ioncsere acetát formájú gyengén bázisos gyantán; hidrofób abszorpciós kroma'ográfia helyettesítetlen polisztirol-divinilbenzol gyantán (pl. Amberlite XAD típusún), szilikagél adszorpciós kromatogrâfia; ioncserés kromatográfia karboximetil-cellulózon; megoszlásos kromatográfia pl. Sephadex G-25-ön vagy ellenáramú megosztással; nagynyomású folyadrkkromatográfia fHPLC), előnyösen reverz fázisú HPLC oktil- vagy oktadecilsziiil-szilíciumdioxid kötött fázisú oszlop tölteten. Ha 3 6-os helyzetben racém aminosavat használunk, a diasztereomer nonapeptid vagy dekapeptid végtermékeket elválasztjuk és a kívánt, 6-os helyzetben D-anrinosavat tartalmazó pepiidet elkülönítjük, és előnyösen a fentiekben ismertetett kromatográfiás módszerekkel tisztítjuk. 5
