185312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminosav- és peptid származékok védőcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában fém nátriummal
I 185 312 2 10 mmol N-benziloxikarbonil-L-tirozinamidot 20, illetve 30 mg-atom fémnátriummal reagáltatva, az első reakcióban csak a várt L-tirozinamidot, míg a második reakcióban ezen kívül még L-tirozinol képződését kimutattuk kis mennyiségben az elektroforetogramon. 3. A karboxamidcsoport hidrolízise ( dezamidálódás) Az N-benziloxikarbonil-glicinamid redukciójakor a várt glicinamidon kívül glicint is kimutattunk az elektroforetogramon. 4. Az N-terc-butiloxikarboml-csoport hasadása Az N-terc-butiloxikarbonil-L-tirozinamid és izoaszparagin redukciójakor tercier-butil-karbamát képződését észleltük. Az első esetben oszlopkromatográfiás elválasztással 8% tercier-butil-karbamátot izoláltunk. Az elektroforetikus vizsgálatok szerint a reakcióban L-tirozinamid is képződött. A peptidkémiában eddig az N-terc-butiloxikarbonil-csoportot stabilisnak tartották ilyen körülmények között (Anderson, C. W. és McGregor, A. C., J. Am. Chem. Soc. 79, 6180 [1957]; Mühlemann, M. és munkatársai, Helv. Chim. Acta, 55, 2854 [1972]). 5. Dezaminálódás Az N-terc-butiloxikarbonil-L-tirozinamid említett reakciójában nemcsak N-terc-butiloxi-karbonil-L-tirozinol és L-tirozinamid képződését mutattuk ki, hanem oszlopkromatográfiás elválasztással 12% 3-(4-hidroxi-fenil)-propionsavamidot is izoláltunk, amelynek szerkezetét infravörös, 'H- és l3C- magmágneses rezonanciaszínképével igazoltuk. Ugyanilyen káros átalakulást figyeltünk meg az N-terc-butiloxikarbonil-L-feni!-alaninamid redukciójában is. Ez a dezaminálási reakció eddig ugyancsak ismeretlen volt a szerves és peptidkémiában. 6. Egyidejű transzpeptidáció és dezamidálódás 5 mmo! N-benziloxikarbonil-L-aszparaginilglicinamidot 15 mg-atom fémnátriummal reagáltatva nemcsak a várt L-aszparaginil-glicinamidot mutattuk ki az elektroforetogramon, hanem alfa- és béta-L-aszpartil-giicinamidot is, mégpedig a béta-peptidből nagyobb mennyiséget. A redukció során képződő L-amino-szukcinil-glicinamid hidrolíziséből származó peptidek mennyisége megközelítette a 20%-ot. A védőcsoport-eltávolítást az elméletileg szükséges 10 mg-atom fémnátriummal végezve ezek a melléktermékek csak 1-2%-os mennyiségben képződtek. Megjegyezzük, hogy az előzőekben felsorolt reakciók egyikében sem maradt tartósan kék a reakcióelegy, sőt a reakciók zöménél a beadagolt nátrium anélkül oldódott föl, hogy a reakcióelegy tömege megkékült volna. Az előzőekben említett, részben a szakirodalomban leírt, részben az általunk felismert, nemkívánatos mellékreakciók egyértelműen arra utalnak, hogy a fémnátrium fölöslegben való alkalmazása káros; az eddigi gyakorlatban teljesen általánosan elfogadott, kék színnel jelzett végpont elfogadása a peptidkémiai redukcióban nátriumfölösleget jelent, és igy mellékreakciókhoz vezet. Párhuzamos reakcióinkból egyértelműen az a következtetés vonható le, hogy a peptidkémiában a védőcsoportok eltávolításához a nátriumot az elméletileg számított mennyiséghez képest csak kis fölöslegben kell alkalmazni, mivel a védőcsoport-eltávolítással egyidejűleg lejátszódó sóképzések is fogyasztanak kevés nátriumot. Minthogy párhuzamos, bár sokkal kisebb sebességgel lejátszódó reakciókról van szó, ezek a reakciók nem küszöbölhetők ki teljesen. Viszont ha a párhuzamos reakciók lejátszódásához szükséges fémnátriumot is beadagoljuk a reakcióelegybe, teljessé válnak ezek és az ezeket kísérő mellékreakciók, és az igy megvalósított reakciók végpontját már valóban az eddig általánosan elfogadott kék szín megjelenése jelzi. Az elméletileg számított mennyiségű nátrium alkalmazásával teljesen elkerülhető a karboxamidcsoport redukciója alkohollá, az N-terc-butiloxíkarbonil-csoport hasadása, a megképződött hidantoinszármazék továbbalakulása és a dezaminálódás, hasonlóképpen jelentős mértékben visszaszorul az egyidejűleg lejátszódó transzpeptidáció és dezamidálódás. %■ Az elméletileg szükséges fémnátrium mennyiségét minden esetben a fémnátriummal elíávolitandó védőcsoportok száma alapján állapítjuk meg (védőcsoportonként 2 g-atom/mól); így például a három eltávolitandó védőcsoportot tartalmazó oxitocin esetében 6 g-atom/mól az elméletileg szükséges fémnátrium-mennyiség. Ez a számitási alap olyan esetekben is érvényes, amikor a molekula egyéb elemi nátriummal reagálni képes csoportokat is tartalmaz, hiszen az eljárás célja éppen a védőcsoportok szelektív lehasitása, vagy annak elkerülése, hogy ezek az egyéb csoportok is reagáljanak a nátriummal. Ha a kezelendő pepiid fémnátriummal nem reagáló csoportokat vagy szubsztituenseket is tartalmaz, ezek a találmány szerinti eljárást nem zavarják, így ezeket nem szükséges figyelembe venni. Eljárásunk széles körű alkalmazhatóságát mutatja az oxitocin gyártása N-benziloxikarbonil-%benzil-L-ciszteinil-L-tirozi!-L-glutaminil-L-aszparaginil-S-benzil-L-ciszteinil-L-prolil-L-leucil-glicinamidból (védett nonapeptidamid, N-benziloxikarbonil-S,S'-dibenzil-oxitocein) és S,S'-dibenziloxitoceinböl. 7,5 g (5,67 rnmol) védett nonapeptidamidot vízmentes körülmények között keveréssel 1 liter cseppfolyós ammóniában oldunk, és az oldatba 913 mg (39,7 mg-atom, 7 g-atom/mol pepiid) fémnátriumot szórunk. A nátrium 5 perc alatt úgy elreagál, hogy az oldat nem kékül meg ezalatt öszszefüggően. A tiszta oldatot vákuumban bepároljuk. A szilárd maradékot 6 liter ionmentes vízben oldva a szokásos módon (151 959 sz. magyar szabadalmi leírás) hidrogén-peroxid jelenlétében leve5 n 15 20 25 20 35 40 45 50 55 60 65 4
