185312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminosav- és peptid származékok védőcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában fém nátriummal
1 185 312 2 gő-átbuborékoltatással oxidáljuk. Ilyen módon összesen 1,88 millió NE oxitocint kapunk, amely az oxitocín 450 NE/mg biológiai aktivitásával számolva 73,2%-os hozamnak felel meg. Azonos mennyiségű védett nonapeptidamid redukcióját 11 g-atom/mól pepiid fémnátriummal végezve 1,49 millió NE (58,2%) oxitocint kapunk. A redukció során a reakcióelegy átmenetileg megkékült, majd végeredményben fehér szuszpenziót kaptunk. 15,4 g-atom/mól peptid fémnátríummal redukálva a védett nonapeptidamidot 0,83 millió. NE (32,2%) oxitocint kapunk. Ebben a redukcióban már tartósan kék szuszpenzió maradt a reakcióelegy, és a nátrium fölöslegét ammóniumkloriddal reagáltattuk el. Hasonló eredményeket kaptunk az S,S'-dimbenzil-oxitocin redukciójakor is. A biológiai aktivitás maximumát ebben az esetben 5 g-atom/mol peptid fémnátriummal értük el. Ez megfelel annak a 7 g-atom/mol peptid nátriummennyiségnek, amelyet a védett nonapeptidamid optimális redukciójához használtunk, mivel ebben az esetben nincs szükség az N-benziloxikarbonil-csoport hasítására. A védett nonapeptidamid redukcióját 56,7 mmolos méretben is elvégeztük 7 g-atom/mol peptid fémnátriummal. Teljesen hasonló eredményeket kaptunk, mint az előző, kisebb méretben végzett reakcióban. Megjegyezzük, hogy az oxitocingyártás során kapott oldat oxitocinkoncentrációját nemcsak biológiai értékméréssel, hanem nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálattal is meghatároztuk, és a két vizsgálat eredményei megegyeznek egymással. Mindezek a tapasztalatok és megfigyelések azt igazolják egyértelműen, hogy a peptidek tozil- és benzilcsoportjának eltávolításához nem szükséges a reakció végpontjaként a rövidebb-hosszabb ideig tartós kék szín fenntartása. Ehelyett, a peptid aminosav-összetételétől függően, csupán kis feleslegben alkalmazzuk a nátriumot. Az elméletileg szükséges nátrium mennyiségét fémnátriummal eltávolítható védőcsoportként 2 g-atom/mol peptid értéknek fogadjuk el. Már maga ez is kis felesleget jelent, mivel minden reakcióban 1,2-difenil-etán is képződik. A peptid egyéb funkciós csoportjainak sóképzése káros mellékreakciók forrása, ezért csak akkora fölöslegben adagoljuk a nátriumot, hogy a védőcsoportok hasítási reakciójával kompetitiv reakciókban fogyó nátrium mennyiségét pótoljuk a védőcsoportok hasításának teljessé tételére. Olyan esetekben, amikor már ez a nátriumfölösleg is mellékreakciókhoz vezet, célszerű a nátriumot az elméletileg számítottnál kisebb mennyiségben alkalmazni, mivel így a kívánt végtermék jobban izolálható a védőcsoporto(ka)t tartalmazó peptidek mellől, mint az esetleg hasonló sajátságú melléktermékektől a tisztítási műveletek során. A találmány tárgya tehát olyan új eljárás védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok N-benziloxikarbonil-, O- és S-benzil- valamint N-p-toluolszulfonil-védőcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában, fémnátriummal, amelynek során a fémnátriumot a védőcsoportok eltávolításához elméletileg szükséges menynyiség 90-115%-ának megfelelő, de a reakcióelegy teljes térfogatában kék színeződést okozó mennyiségnél kisebb mennyiségben alkalmazzuk. Olyan esetekben, amikor a védett peptid a lehasítandó védőcsoportokon kívül más nátriummal reagáló csoportot, így különösen hidroxil-, karboxil- és/ vagy karboxamidcsoportot, továbbá például imidazoI-NH vagy indol-NH csoportot is tartalmaz, a fémnátriumot célszerűen csak a védőcsoportok eltávolításához elméletileg szükséges mennyiség’ 90-100%-ának megfelelő mennyiségben alkalmazzuk. Ezáltal kellő mértékben biztosítjuk az eljárás szelektivitását, minthogy az említett egyéb csoportokkal a fémnátrium sokkal lassabban reagál és így ezek csak az elméleti mennyiséget meghaladó nátrium jelenlétében lépnének számottevő mértékben reakcióba. így a találmány szerinti eljárással biztosíthatjuk, hogy a védőcsoport(ok) fémnátríummal történő lehasításakor az adott esetben jelenlévő egyeb, fémnátriummal reagálni képes csoportok legfeljebb csak minimális mértékben lépjenek a nátriummal reakcióba és egyéb káros mellékreakciók se lépjenek fel számottevő mértékben. A találmány szerinti eljárás nemcsak a védőcsoport-eltávolítási reakció egyértelműbb megvalósítását teszi lehetővé, amely ebben az esetben nagyobb hozamot, tisztább és könnyebben tisztítható végterméket jelent, hanem a reakciók méretének jelentős növelését, akár ipari méretű megvalósítását is anélkül, hogy ez károsan befolyásolná a végtermék minőségét, és csökkentené a hozamot. Eljárásunk előnye, hogy az említett mellékreakciókra vagy egyáltalán nincs lehetőség, vagy a minimumra szoríthatók vissza, A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik. \ példákban az aminosav- és peptidszármazékok jelölésére használt rövidítések az IUPAC.IUB által ajánlottak (J. Bioi. Chem. 247, 977 1972). További rövidítések: Z = N-benziloxikarbonil, ‘Bj = tercier-butil, Boc = N-terc-butil-oxikarboni , Bzl = benzil, Hse = L-homoszerin. Az olvadáspont-meghatározások dr. Tottoli-féle készülékben (Büchi, Svájc) történtek. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokat előregyártóit kovasavgél adszorbensen (DCFertigplatten, Merck) végeztük az alábbi oldószereiegyekben: 1. etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20: 6: 11) = = 19:1 2 etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20: 6: 11) = = 9:1 3 etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20:6:11) = ■ = 4:1 4 etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20:6:11) = 3:2 5 etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20:6:11) = = 2:3 A krorrtátogramokat ninhidrinnel, valamint klórozást követően Kl-tolidinnel hívtuk elő. Az anyagkeverékek oszlopkromatográfiás elválasztásához 62-200 fim szemcseméret-tartományú kovasavgélt (Kieselgel G) használhatunk. Az eluciót etil-acetáttal vagy az előzőekben felsorolt oldószereiegyekkel végeztük. Az elválasztandó anyag-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
