185308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotrop hormonokra ható peptidek előállítására
1 185 308 2 alatt történő, egy éjszakáig tartó keverésével végezzük. A felesleges etil-aminnak csökkentett nyomáson történő desztillációval való eltávolítása után a gyantát metanolban szuszpendálva, az elegyből szűréssel távoUtjuk el. A gyantát ezután tovább mossuk, egymás után dimetilformamiddal, metanollal és dimetil-formamid-metanol keverékkel. A lehasított, védett peptid kinyert oldatát szárazra pároljuk rotációs vákuumbepárlón, szobahőmérsékleten. A peptid oldására minimális mennyiségű metanolt használva, az oldatot cseppenként 250-szeres térfogatú, száraz éterhez adjuk, keverés közben. Pelyhes csapadék keletkezik, amely centrifugálással eltávolítható. A kinyert csapadékot megszárítjuk, így kapjuk a közbenső terméket, melyről teljesen eltávolítjuk a védőcsoportokat, hidrogén-fluoridot használva 0 °C-on, és anizolt adva hozzá, mint a szennyezéseket eltávolító anyagot. A hidrogén-fluoridot csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a gyantát extraháljuk és a mosólevet liofilizáljuk, s így nyers peptid-port kapunk. A peptid tisztítását ioncserélő kromatográfiával végezzük CMC oszlopon, majd ezt megoszlási kromatográfiával folytatjuk, a következő eluáló-rendszert használva: n-butanol : ecetsav :víz(4:1:5 térfogatarányban). A megoszlási kromatográfiás oszlop töltete Sephadex G-25. A [pN02-D-Phe6, Pro9NEt]-LRF-et homogénnek minősítjük vékonyréteg-kromatográfiás alapon, számos különböző oldószer-rendszer, valamint reverz fázisú folyadék-kromatográfia alkalmazásával, (vizes trietilammónium-foszfát plusz acetonitril-oldattal). A kapott, tisztított peptid aminosav analízise megegyezik a feltételezett szerkezettel, mivel egész szám értékeket mutat minden egyes aminosavra a láncban. Az optikai rotációs fotoelektromos polariméteren mérve [a]jg = —47,2° (c ■ 1,1 % sceím) értéket kapunk. Az előzőekben felállított, szilárd fázisú eljárást használva, a 2. és 3. peptideket is előállítottuk. Ezeket az I. táblázatban ismertetjük. Képletük a következő: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-RrLeu-Arg-Pro-NHCH2-CH3. 2 I. Táblázat Peptid R. 2. [aJo — 57,0+1° (R, = CH30-D-Phe) . (c = 1, 1 %-os ecetsav) 3. [a]o = 59,0±1° (Rí = CH3 -D-Phe) (c = 1, 1 %-os ecetsav) 2. példa Az 1. példában előállított peptideket diszpergált patkány agyalapi sejtek 4 napos primer kultúráját használva vizsgáljuk in vitro, és hasonlítjuk össze LRF-fel. A peptidek alkalmazására 4 órás periódusban válaszul kiválasztott PH mennyiségét vizsgáljuk, speciális radioimmun módszerrel patkány LH-ra. A vizsgálat eredményeit a következő táblázatokban mutatjuk be: II. Táblázat (2. számú peptid) Kezelés Kiválasztott LH nanogramm/ml 4 óra kontroll 627 0,3 nm LRF 898 1,0 nm LRF 1240 3,0 nm LRF 1702 0,01 nm 2. sz. peptid 1467 0,03 nm 2. számú peptid 1723 A 2. számú peptid relatív hatékonysága 130(72- 242). Ezeknek a vizsgálatoknak az. alapján látható, hogy [OCH2-D-Phe6, Pro9-NEt]-LRF hatékonysága körülbel il 130-szor akkora, mint az LRF-é. Az 1., és 3. peptidekre hasonló in vitro vizsgálatokat végeztünk, és az. eredmények a III. táblázatban találhatók: III. Táblázat Peptid száma Hatásosság (LRF-re vonatkoztatva) 1 141 (83-297) 3 143 (79-268) Az 1. példa szerint előállított peptid-készítmények hatásosságát vizsgáljuk in vivo is, és az in vitro vizsgálatokban megállapított relatív agon ist a hatásosságát vlz5gdlva ez Jól korrelál sz In vivő tesztben kapott hatásossággal. Az eredmények összehasonlítása azt mutatta, hogy az összes peptid-készíímény nagyon szignifikánsan hatásosabb, mint az LRF in vivo körülmények között vizsgálva. Az előzőek alapján a találmány szerinti peptideket felhasználhatjuk hím és nőstény állatok, valamint emberek termékenységének szabályozásában. Ezeknek a peptideknek magas és gyakori adagolása meggátolja a megtermékenyülést az ovuláció gátlásával, ideértve az idő előtti luteolízist és a terhesség megszakítását nőstényeknél, valamint a spermaképződést hímeknél. Alacsony szintű, időszakos adagolással helyreállítható azoknak a meddő állapotoknak a termékenysége, melyet az LRF-hiány okoz, és normál nőstényeknél megengedi az ovuláció időzítését. A peptidek használhatók a nemi szteroidok szintjének csökkentésére, és így használhatók olyan betegségek kezelésében, mint a nemi hormon függő kóros szövetképződés, idő előtti serdülés, endomotriózis vagy fájdalmas menstruáció. Mint az előzőekben említettük, a peptideket adagolhatjuk intravénás, szubkután, szublingvális, orális, intravaginális, intranazális vagy rektális módon. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-R^Leu-Arg-Pro-NH-CHíCHa ál-alános képletű peptidek előállítására, ahol 5 10 15 20 25 30 40 45 50 55 60 65 5
