185308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotrop hormonokra ható peptidek előállítására
1 185 308 2 Xs az Arg nitrogénatomjainak védőcsoportja, és a következő csoport lehet: nitro-, Tos, benziloxi-karbonil-, adamantiloxi-karbonilcsoport, és BOC; vagy hidrogénatom, amely azt jelenti, hogy nincs védőcsoport az arginin nitrogénatomjain. X6 etil-amincsoport vagy O—CH2ígyanta] maradék. Ha az X® csoport 0-CH2 -[gyanta], ez azt jelenti, hogy a polisztirol gyanta funkcionális csoportja egyikének az észtere. Az X2-Xs oldallánc védőcsoportok megválasztásának az a kritériuma, hogy a védőcsoport ellenálljon a reagensnek az a-amino-védőcsoport eltávolításához választott reakciókörülmények között a szintézis minden egyes lépésénél, a védőcsoportnak nem szabad lehasadni a kapcsolási körülmények között, és a kívánt aminosavsorrendet szolgáltató szintézis elvégzése után eltávolítható Jegyen a védőcsoport olyan körülmények között, amelyek nem változtatják meg a peptid-láncot. A peptidek védőcsoportjainak eltávolítása célszerűen 0 °C-on, hidrogén-fluoriddal, vagy más, megfelelő reagenssel végezhető. Anizol, vagy néhány más, megfelelő, a szennyeződéseket eltávolító vegyszer, például metilanizol vagy tio-anizol adható előnyösen a pepiidhez, a hidrogén-fluoriddal történő kezelés előtt. A hidrogénfluorid csökkentett nyomáson történő eltávolítása után a védőcsoportjaitól megfosztott peptidet éterrel kezeljük, szűrjük, híg ecetsawal extraháljuk, szűréssel elválasztjuk a gyantától, majd liofilizáljuk. A peptid tisztítását ioncserélő kromatográfiával végezhetjük, karboximetil-cellulóz (CMC) oszlopon, majd megoszlási kromatográfiával gélszűrő oszlopon a következő eluálórendszerrel: n-butanol : ecetsav : víz (4:1:5 térfogatarányban). Sephadex G-25 lehet a megoszlási kromatográfiás oszlop töltete, és más kation-cserélők, például CM-Sephadex. Ellenáramú megoszlást is használhatunk a tisztításhoz. A peptidek alkalmazhatók nőstény emlősökben az ovuláció keltésére, valamint használhatók más gyógyászati célokra is, melyekre eddig az LRF-et használták. Mivel a találmány szerinti peptidek hatásossága körülbelül 30-150-szer nagyobb, mint az LRF-é (lásd IV. táblázat) minden egyes alkalmazásnál a dózist ennek az aránynak az alapján lehet meghatározni, más tényezőket, mint például az adagolás álanyát fígyelembevéve. Például a megfelelő dózis 5 mg-tól 10 pg-ig terjedhet naponta testsűly/kilogrammra számítva. A peptidet az emlősöknek intravénásán, szubkután, intramuszkulárisán, intranazálisan, vaginálisan, orálisan vagy szublingválisan adhatjuk. Az effektiv dózis változik az adagolás módjával, valamint az emlős fajtájával. Az orális adagolás történhet szilárd vagy folyékony formában. 1. példa A következő képletű p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-pN02- D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH—CH2CH3 [pN02-D-Phe®, Pro9- NEt]-LRF-et a szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő. Sztirol és körülbelül 1% divinil-benzol kopolimerizációjával előállított klór-metilezett gyantát használunk, és a BOC-védett prolin trietil-ammóniumsóját észterezzük a gyantára, etanolban refluxáltatva, körülbelül 48 órán át. Az egyes aminosavak kapcsolása a mosás, a védőcsoport eltávolítása, valamint a következő aminosav kapcsolása a következő séma szerint megy végbe, automatizált berendezés használatával, és körülbelül 5 g gyantát használva kiindulásnál. Lépés Reagensek és műveletek Keverési idő percben 1 diklór-metános mosás, 80 ml (kétszer) 3 2 metánolos mosás, 30 ml (kétszer) 3 3 diklór-metános mosás, 80 ml (háromszor) 3 4 50%-os trifluor-ecetsav (TFA) + + 5% 1,2-etán-ditiol, diklórmetánban, 70 ml (kétszer) 10 5 diklór-metános mosás, 80 ml (kétszer) 3 6 trietil-amin 12,5 %-s oldata, 70 ml diklór-metánban (kétszer) 5 7 metil-alkoholos mosás, 40 ml (kétszer) 2 8 diklór-metános mosás, 80 ml (háromszor) 3 9 BOC-aminosav (10 mmól), 30 ml DMF-ben, vagy diklór-metánban, az egyes védett aminosav oldhatóságától függően (egyszer) + + diciklohexil-karbodiimid(DCC) (10 mmól), diklór-metánban 30-300 10 metil-alkoholos mosás, 40 ml (kétszer) 3 11 12,5 % trietil-amin, diklór-metánban, 70 ml (egyszer) 3 12 metánolos mosás, 30 ml (kétszer) 3 13 diklór-metános mosás, 80 ml (kétszer) 3 A 13. lépés után a ninhidrin-teszthez kiveszünk egy alikvot részt: ha a teszt negatív visszatérünk az 1. lépéshez a következő aminosav kapcsolására; ha a teszt pozitív, vagy enyhén pozitív, az eljárást ismételni kell. a 9. lépéstől a 13. lépésig. A fenti sémát a peptid minden egyes aminosavának a kapcsolására használjuk, miután az első aminosavat már kapcsoltuk. NaBOC védelmet használunk minden egyes aminosavhoz, amíg a pGlu-t el nem érjük. Az Arg oldailáncát Tos-sel védjük. Az OBzl csoportot a Ser hidroxilcsoportjának védelmére a 2,6-diklór-benzilcsoportot a Tyr hidroxilcsoportjának oldallánc védőcsoportjaként használjuk. A p-toluol-szulfonilcsoport (Tos) a His 2-helyzetben lévő védőcsoportjaként használható. pGlu bevitelét vagy a benziloxi-karbonilcsoporttal (Z) védett aminosavként, vagy tiszta pGlu-formában végezzük. A következő aniinosavaknak, melyek gyengén oldódnak diklór-metánban, a DMF oldószere: BOC\rg(Tos); BOC-Trp és Z-pGlu vagy pGlu. A teljesen védett peptidet a gyantáról aminolízissel rávolítjuk el, etil-amint használva, és így nyerjük a teljesen védett alkil-amíd köztiterméket. A peptid hasítását a gyantának desztillált etil-aminban, 0 °C-on, nyomás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
