185308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotrop hormonokra ható peptidek előállítására
1 185 308 2 nők kiválasztásában, és a következő képlettel jellemezhetők: p-Glu-His-Trp-Ser-Typ-Ri -Leu-Arg-Pro-NH— CH2-CH3, ahol az Rj csoport jelentése metil-D-Phe, nitro-D-Phe, egy metoxi-D-Phe, és Phe jelentése fenilalanin. A találmány szerinti, 6-helyzetben módosított DPhe-t, valamint az etilamin-módosítást tartalmazó peptidek nagymértékben megnövekedett hatásossággal rendelkeznek más, ismert LRF analóghoz hasonlítva, melyeket korábban leírtak, például a 3.896.104., 3.972.859., és 4.034,082. számú amerikai szabadalmi leírásokban. Ezeknek az LRF agonistáknak a megnövekedett hatása nagyon értékessé teszi őket, mind a hím és nőstény meddőség kezelésében, valamint mind hímeknél és nőstényeknél a szaporodási funkciók gátlásánál, a hosszú ideig tartó adagolás eredményeként. A találmány szerinti peptideket a szilárd fázisú technika segítségével szintetizáljuk. A szintézist előnyösen lépésenként, klór-metilezett gyantán végezzük. A gyanta finom szemcseméretű (20-70 fi átmérőjű) szintetikus gyantából áll, mely sztirol és 1—2% divinilbenzol kopolimerizációjával készül. A klór-metilezett gyantánál a gyantában lévő benzolgyűrűk Friedel—Crafts reakcióban ídór-metilezzük klór-metil-éterrel és ónkloriddal, és a klórt, mint reaktív benzil-kloridot visszük be. A Friedel-Crafts reakciót mindaddig folytatjuk, míg a gyanta 0,5-2 inmól klórt tartalmaz 1 g gyantánként. Az alkalmazott reagensek a kémiai nevük és közismert rövidítésük alapján vannak ismertetve. Pepiidet készíthetünk például, ha az a-aminocsoportján védett Pro aminosav trietil-ammóniumsóját észterezzük a klór-metilezett gyantára, etanolban végzett visszafolyatással, körülbelül 48 órán át, Használható még az a-amlnocsoportján védett Pro, kálium vagy céziumsói dimetil-formamidban (DMF), vagy dimetil-szulfoxidban (DMS) 40-80 °C közötti hőmérséklettartományban. További lehetőség az a-aminocsoportján védett prolin oldása DMF-ben, a klór-metilezett gyantával együtt, KF jelenlétében. Miután az a-aminocsoport védőcsoportját eltávolítottuk az N-végről, és semlegesítettük, az N-védett aminosavak lépésenként! hozzáadását Monahan és munkatársai módszerével végezzük [Biochemisty, 12, 4616-4620(1963)]. A szintézis során a kapcsolási reakciót a ninhidrinteszttel követjük, amint azt Kaiser és munkatársai leírták [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)]. A védőcsoport eltávolítását 5% 1,2-etán-ditiolt tartalmazó ecetsavban (TFA) való 20 perces kezeléssel, majd ezt követő trietilaminos semlegesítéssel DMF-ben vagy diklór-metánban végezzük. Minden egyes lépést számos metií-alkoholos vagy diklór-metános mosás követ. Az egyes aminosavakat egymás után kapcsoljuk össze, és így készítjük el a peptidláncot. Az a-nitrogéncsoportokat t-butoxikarbonilcsoporttal (BOC), valamint az Arg oldalláncát p-toluol-szulfonil csoporttal (Tos) védjük. A Ser és Tyr oldalláncainak védelmére benzil-észtert (OBzl) használhatunk. A Tyr oldalláncának védelmére 2,6-diklór-benzilcsoportot használhatunk; és a His oldalláncának védőcsoportjaként Tos, dinitro-fenil (Dnp), vagy BOC használható. A pGlu bevihető például, mint benziloxi-karbonilcsoporttal védett aminosav, vagy minden védelem nélkül. Ezzel a módszerrel kapjuk a teljesen védett peptidgyanta vegyületet, és a teljesen védett pepiidet megfelelő módon eltávolítjuk a gyantáról, például ammónia alkalmazásával, vagy aminolízissel, és így kapjuk a teljesen védett alkil-amid intermediert. Egyik példaként a peptid lehasítását a gyantáról a peptid-gyanta vegyületet (.. , Pro-0-CH2-gyanta) egy éjszakán át desztillált etilaminban, 0 °C-on keverve végezhetjük, nyomás alatti edényben. Miután a felesleges etil-amint nitrogén alatt, vagy csökkentett nyomáson végzett desztillálással eltávolított, a metanolban szuszpendált gyantát az elegyből szüléssel eltávolítjuk. A gyantát ezt követően tovább mossuk dimetil-formamiddal (DMF), metanollal, valamint metanol és DMF keverékével. A lehasított védett peptid kinyert oldatát szárazra pároljuk rotációs vákuumbepárlón, szobahőmérsékleten. A pepiidet minimális mennyiségű metanolban oldjuk. Az oldatot keverés közben, 200-szoros térfogatú, feleslegben lévő, száraz éterhez csepegtetjük. Pelyhes csapadék keletkezik, melyet szűréssel vagy centrifugálással nyerünk ki. A kinyert csapadékot megszárítjuk, és így kapjuk a köztiterméket, amely a találmány része. A találmány szerint alkalmazott intermediereket a következő képlettel jellemezzük: X1 -p-Glu-His(X2)-Trp-Ser(X3)-Tyr(X4)-R, - Leu-Arg(X5)-Pro-X6, ahol X1 vagy hidrogénatom, vagy egy a-aminocsoportot védő csoport, amely az irodalomban ismert módon használatos a polipeptidek lépésenkénti szintézisére. X1 a-amino védőcsoportok a következők: (1) acil-típusú védőcsoportok, például formil-, trifluor-acetil-, ftaiil-. Tos, benzol-szulfonil-, nitrofenil-szulfenil-, tritil-szulfenil-, p-nitrofenoxi-acetil-, klór-acetil-, acetil és a-klórbutirilcsoport; (2) aromás uretán-típusú védőcsoportok, például benziloxl-karbonil-, és helyettesített benziloxikarbonilcsoportok, olyan, mint p-klór-benziloxi-karbonil-, p-nitro-benziloxi-karbonil-, p-bróm-benziloxi-karbonil- és p-metoxi-benziloxi-karbonilcsoport; (3) alifás ureián védőcsoportok, például BOC, diizopropil-metoxikarbonil-, izopropiloxi-karbonil-, etoxi-karbonil- és allil'' oxi-karbonilcsoport; (4) cikloalkil-uretán-típusú védőcsoportok, például ciklopentiloxi-karbonil-, adamantiloxi karbonil- és ciklohexiloxi-karbonilcsoport, (5) tiourei án-típusú védőcsoportok, például a feniltio-karbonilcsoport; (6) alkil-típusú védőcsoportok, például a trifeml-metil- (tritil) és benzilcsoport; (7) trialkil-sziláncsoportok, mint például trimetil-szililcsoport. Az előnycsen alkalmazott a-amino-védőcsoport a BOC. X2 az imidazol nitrogénatomjának védőcsoportja és jelentése Tos, benzil-, tritil-, 2,2.2-trifluor-l-benziloxí-karbonil-amino-etil-, 2,2 2-trifluor-l-terc-butiloxi-karbonil-amino-etil, valamint 2,4 dinitro-tiofenilcsoport. X3 a szerin aminosav alkoholos hidroxilcsoportjának védőcsoportja, és jelentése a következő: acetil-, benzoil-, tetrahidro-piranil-, terc-butil-, tritil-, benzil- és 2,6-diklór-benzilcsoport, előnyösen benzilcsoport. X4 a Tyr fenolos hidroxiljának védőcsoportja, és jelentése a következő: tét ahidro-piranil-, terc-butil-, tritil-, benzil-, benziloxikarbonil-, 4-bróm-benziloxi-karbonil- és 2,6-diklór-benzik söpört. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
