185249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-prekurzor előállítására
1 2 185.249 Természetes inzulin Inzulin természetes proinzulinból Inzulin az előállított proinzulinból Val ' 4,49 4,54 4,51 Ile 0,54 0,58 0,55 Leu 5,87 5,83 5,86 Tyr 3,90 3,84 3,93 Phe 2,88 2,83 2,89 His 1,93 1,90 1,99 Lys 0,99 1,06 LI9 Arg 0,99 0,98 0,99 3. példa: A hőmérséklet hatása 5. példa: A protein hatása 5 Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk a protein koncentrációnak a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított szarvasmarha proinzulin kitermelésre gyakorolt hatását. Több reakciót egy- 1C időben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a kővetkezők voltak: puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptán reagensként olyan mennyiségű 2-merkaptoetanol, melynél egy —SSO,“ ionra 4 mól —SH csoport jut; reakcióidő 15 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C. A proinzulin terméket, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint az alábbi kitermelésben nyertük: Az I. példa szerinti eljárás alkalmazásával meghatároztuk a hőmérsékletnek a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított szarvasmarha proinzulin kitermelésre gyakorolt hatását. A reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,1 mg/ ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptán reagensként olyan mennyiségű 2-merkaptoelanol, melynél egy —SS03 ionra 4 mól — SH cső port jut; reakcióidő 18 óra. Ha a reakció kivitelezését 21 °C hőmérsékleten végeztük, akkor a proinzulin kitermelés HPLPLC vizsgálat szerint 47% volt. Ha a reagenseket 21 °C-on elegyítettük, majd az elegy hőmérsékletét 6 °C-ra csökkentettük, akkor a kitermelés 77% volt. 4. példa: A pH hatása Az 1. példa szerinti eljárás alkalmazásával meghatároztuk a pH-nak a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított bovin proinzulin kitermelésre gyakorolt hatását. Több reakciót egyidőben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0.5 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; merkaptán reagensként olyan mennyiségű 2-merkaptoetanol, hogy egy —SSO,“ ionra 2 mól —SH csoport jusson; reakcióidő 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C. A proinzulin terméket, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint az alábbi kitermelésben nyertük: pH_______________________________Kitermelés (%) 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 43,1 44,3 66,7 76.0 61.0 Protein koncentráció (mg/ml) Kitermelés (%) 20 A NUHtciiuauu \/Of 0,1 78 0,2 63 0,3 46 0,4 37,6 25 0,5 25,4 1,0 12 Egy másik reakció-sorozatnál, ahol egy — SSO-/ ionra 2 mól —SH csoport jutott és 30 ahol a pH 10,5 volt, az alábbi eredményeket nyertük: Protein koncentráció (mg/ml) Kitermelés (%) 0,5 77,2 35 0,96 58,3 1,83 19,5 4,2* 20,1 7,4* 19,6 * —SH:—SSOJ arány = 1,2 Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk az —SH: —SS03 aránynak a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinból előállított szarvasmarha proinzulin kiter- 45 melcsre gyakorolt hatását. Több reakciói egyidőben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,5 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; reakcióidő 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C. 50 A proinzuünl, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint, az alábbi kitermelésben nyertük: — SH: — SS03 arány Kitermelés (%) 4,0 30,8 2,0 44,7 1,0 37,0 0,5 7. példa: 4,5 A merkaptán reagens hatása Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk, hogy a lineáris láncú S-szulfonát szarvas- 65 marha proinzulinból előállított szarvasmarha pro-6
