185249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-prekurzor előállítására
1 Xi 249 inzulin kitermelésre a különböző típusú merkaptánok milyen hatással vannak. Több reakciót egyidöbcn végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,1 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptán, egy —SSO ónra 4 mól —SH csoport jut; reakcióidő 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C. A proinzulint, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint, az alábbi kitermelésben nyertük: Merkaptán Kitermelés (%) ditiotreitol 39.3 ditioeritritol 34,9 metil-tioglikolát 56,1 3-merkapto-1,2-propándiol 65,5 3-merkaptopropionsav 65,3 2-merkaptoetanol 64,1 8. példa: A protein hatása Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával meghatároztuk, hogy a különböző típusú proteinek a lineáris láncú S-szuifonát proinzulinból előállított proinzufin kitermelésre milyen hatással vannak. Több reakciót egyidőben végeztünk és ezeknél a reakciókörülmények a következők voltak: protein koncentráció 0,1 mg/ml; puffer 0,05 mólos glicin; pH 9,5; merkaptánként olyan mennyiségű 2-merkaptoetanol, hogy egy — SS03 ónra 4 mól —SH csoport jusson; reakcióidő 18 óra; reakcióhőmérséklet 6 °C. A proinzulint, HPLPLC-vel végzett vizsgálat szerint, az alábbi kitermelésben nyertük: Lineáris láncú S-szulfonát proinzulin________________________Kitermelés (%) szarvasmarha 60.6 sertés 65,8 9. példa: Human proinzulin előállítás 169,3 mg lineáris láncú S-szulfonát humán proinzulint feloldunk 338,6 ml gázmentesített 0,05 mólos glicinben, pH = 10,54 és ehhez az oldathoz hozzáadtunk egy vizes 2-merkaptoetanol törzsoldatot, melyben Ellman reagenssel való titrálás szerint a merkaptán koncentrációja 2,08 mg/ml. Ez azt jelenti, hogy egy— SSO," ionra, mely a lineáris láncú S-szulfonál human proinzulinban van, 2 mól 2-merkaptoetanol jut. A reakcióelegyet 5 n nátriumhidroxiddal kezelve a pH-t 10,52-re állítjuk be. Az oldatot tartalmazó edényt para ifin filmmel lezárjuk és 6 °C-on 18 órán ál kevertetjük. A reakcióelegyet ezután koncentrált sósavval megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 2,9 ±0,1 legyen (a hőmérsékletet beállítjuk). Az így nyert tiszta oldatot egy Sephadex G-25 Coarse sómentesítő oszlopon kromatografáljuk, mely műveletnél a reakciókörülmények a következők: oldószer 2%-os ecetsav (térf/térf); oszlop mérete 5 x 100 cm; reakcióhőmérséklet 25 °C; átfolyási sebesség 28,8 ml/perc; frakciótérfogata 20,2 ml. Az cluátum első 779 ml-cl elöntjük, a következő 464 ml-t összegyűjtjük és eltesszük, mivel a 280 miinél vizsgált optikai sűrűség alapján ez tartalmazza a proteint. Az oszlopot ezután további 2500 ml 2%-os ecetsavval mossuk. A protein tartalmú eluátum, az UV spektrumból kiszámolva, 164 mg proteint tartalmaz, mely a kromatográfiás eljárásnál alkalmazott mennyiségnek 101,9%-a (az újraképződési reakciónál az elméleti kitermelés). Ezt az eluátumot megfagyasztjuk és liofilizáljuk. A kívánt terméket gél-szüréses kromatográfia alkalmazásával izoláljuk. A szárazanyagot (méretlenül) feloldjuk 20 ml 1 mólos ecetsavban és az így nyert tiszta oldatot Sephadex G-50 Superfine oszlopon kromatografáljuk. A reakció körülményei a következők: oldószer 1 mólos ecetsav; oszlop mérete 2,5 x 125 cm; reakcióhömérséklet 25 °C; átfolyási sebesség 0,82 ml/perc; frakciótérfogat 4,92 ml. Az oszlopot egy éjszakán át I mólos ecetsavval eluáljuk és az eluátum abszorpcióját 280 nm-nél mérjük. Az egyes frakcióknak 280 nm-nél mért abszorpcióképességét a frakciók számának függvényében ábrázolva egy olyan görbét kapunk, melynek két fő csúcsa (maximuma) van. Az első (a kisebb) csúcs az agregált human proinzulint, a második csúcs pedig a monomer humán proinzulint jelzi. A görbe első részén van még egy legömbölyített vállrész. Az alábbi frakciók egyesítésével nyerjük az eluátum I-et, az eluátum Il-t és az eluátum Ill-t, ahol zárójelben a térfogatot is feltüntetjük: eluátum 1 : 46-67 frakciók (218-325,5 ml) eluátum 11 : 68-81 frakciók (325,5-295,5 ml) eluátum 111: 82-100 frakciók (395,5-490,3 ml) Az eluátumok az UV spektrum alapján, az alábbi protein mennyiségeket tartalmazzák: eluátum 1 : 22,1 mg eluátum II : 28,3 mg eluátum III: 103,6 mg Hz összesen 154 mg, mely a kromatográfiás eljárásnál alkalmazott mennyiségnek 94%-a. Ennek a visszanyert mennyiségnek 67,3%-a monomer humán proinzulin. Mindhárom eluátumot, az I, II és a Ill-t, megfagyasztjuk és liofilizáljuk. Az eluátum Ill-ból összesen 106,55 mg száraz anyag nyerhető, mely anyag az aminosav analízis és pofiakrilamid gél-lemezes elektroforézis szerint human proinzulin. HPLC-vel végzett vizsgálatnál az anyag arról a helyről eluálható, ahol a bovin proinzulinhoz viszonyítva a human proinzulin várható. Meghatározható továbbá oly módon is, hogy tripszinnel és karboxipeptidáz B-vel kezeljük és így termékként humán inzulint nyerünk. Szabadult n i igény pori t ok 1. Eljárás I általános képletéi inzulin prekurzor előállítására, ahol a képletben Y jelentése -Lys-Ala- vagy -Lys-Thr, A-2Hg Syök jelentése egy inzulin A-lánc; * gyök jelentése egy inzulin B-lánc; és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
