185249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-prekurzor előállítására
1 185 249 2 Az alábbi példák a találmány szerinti eljárás további magyarázatául szolgálnak, de nem korlátozzák annak oltalmi köret. 1. példa 0,1 mg/ml-es koncentráció 1,61 mg lineáris láncú S-szulfonát bovin proinzulint feloldunk 16,1 ml gázmentesített 0,05 mólos glicinben, a pH 9,5; és ehhez az oldathoz hozzáadunk 0,158 ml vizes 2-merkaptoetanol törzsoldatot, melyben Ellman’s reagenssel való titrálás szerint a merkaptán koncentrációja 2,11 mg/ml. Ez azt jelenti, hogy 4 mól 2-merkaptoetanol jut egy —SS03 ionra, mely a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulinban van. A reakcióelegy pH-ja 9,46. A szobahőmérsékleten előállított oldatot tartalmazó edényt paraffinfilmmel lezárjuk, majd 6 °C-ra lehűtve 19 órán át keverjük. A reakcióelegyet ezután koncentrált sósav és 0,5 N nátriumhidroxid felhasználásával megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 4,0 ±0,1 legyen (a hőmérsékletet beállítjuk). A terméket izoláljuk és nagy teljesítményű kisnyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLPLC) vizsgáljuk. A HPLPLC-nél a reakciókörülmények: oszlop, 1,1x54 cm-es üveg oszlop, mely 16,6% széntartalmú LP--1/C,8 töltetet tartalmaz oldószer 30% acetonitril 70% 0,1 mólos ammóniumformiát, pH 4,25; hőmérséklet 21 °C; nyomás 8028 g/cm2; átfolyási sebesség 2,40 ml/perc. A mintákat egy 5 ml-es fecskendővel visszük fei az oszlopra és a vizsgálatot 280 nm-nél végezzük. Az első vizsgált minta egy 0,1 mg/ml-es nominális protein koncentrációjú szarvasmarha proinzulin törzsoldat 5 ml-e és a második minta 5 ml megsavanyított reakcióelegy. A reakcióelegyben a monomer szarvasmarha proinzulin jelenlétét az eluálás alapján igazoljuk. A két HPLPLC görbe csúcsának területéből kiszámítható, hogy a szarvasmarha proinzulin kitermelése (a reakcióelegyben) 82,6%. 2. példa: 0,5 mgjml-es koncentráció 25,07 mg lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulint feloldunk 50,14 ml gázmentesített 0,05 mólos glicinben, pH 10,51 és ehhez az oldathoz hozzáadunk 1,302 ml vizes 2-merkaptoetanol törzsoldatot, melyben Ellman reagenssel való titrálás szerint a merkaptán koncentrációja 2,10 mg/ml. Ez azt jelenti, hogy 2,1 mól 2-merkaptoetanol jut egy —SS03 ionra. A reakcióelegy pH-ja 10,47. A szobahőmérsékleten előállított oldatot tartalmazó edényt paraffmfilmmel lezárjuk, majd 6 °C-ra lehűtve 18 órán át keverjük. A reakcióelegyet ezután koncentrált sósav és 0,1 N sósav felhasználásával megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 4,0±0,1 legyen (a hőmérsékletet beállítjuk). A reakcióelegynek HPLPLC-vel történő vizsgálata szerint a szarvasmarha proinzulin kitermelése 69%. A terméket, sómentesítés után gél-szüréses kromatográfia alkalmazásával izoláljuk. A reakcióelegy pH-ját koncentrált ammóniumhidroxiddai 9,0-re beállítjuk és egy Sephadex G-25 Course oszlopon kromatografáljuk. A sómentesítést szolgáló kromatográfiás eljárás körülményei a következők: oldószer 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonát; pH 9,0; oszlop mérete 2 x 90 cm; hőmérséklet 21 °C; átfolyási sebesség 18,5 ml/perc. Az eluátum első 120 ml-él elöntjük, a következő 75 ml-t egyesítjük és eltesszük. Ezután az oszlopot további 400 ml 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonáttal mossuk, pH érték 9,0. A protein tartalmú eluátum UV spektroszkópiás vizsgálata szerint a visszanyert protein 21,6 g. Az eluátumot liofilizáljuk és ily módon 22,21 mg száraz, sómentes proteint nyerünk. Ebből az anyagból 14,84 mg-ot 5,5 ml 0,1 mólos ecetsavban feloldunk és az így nyert tiszta oldatban a protein koncentráció 2,56 mg/ml. Ebből az oldatból 5 ml-t (UV vizsgálat szerint 12,8 mg) Sephadex G-50 Superfine oszlopon kromatografálunk. A kromatográfiás reakció körülményei a következők: oldószer 1 mólos ecetsav; oszlop mérete 1,5 x 100 cm; hőmérséklet 21 °C; átfolyási sebesség 0,19 ml/perc; frakció térfogata körülbelül 1,9 ml. Az oszlopot egy éjszakán át 1 mólos ecetsavval eluáljuk és az eluátumnak 280 nm-nél mért abszorpcióját grafikonon ábrázoljuk. A görbén látható két csúcs körül az első a kisebb csúcs, az agregált szarvasmarha proinzulint, és a második pedig a monomer szarvasmarha proinzulint jelzi. A frakciókat egyesítjük és ezek térfogata a következő: Eluátum I: 30-^46 frakciók (55,0-84,0 ml; csúcs 70,4 ml) Eluátum II: 47-62 frakciók (84,0-112,0 ml; csúcs 99,8 ml). Az UV spektroszkópiás vizsgálat szerint az eluátum I-ben 1,94 mg és az eluátum Il-ben 10,11 mg van, mely összesen 12,05 mg és ez azt jelenti, hogy az oszlopra felvitt mennyiség 94,1%-át nyerjük vissza. Ennek a visszanyert anyagnak 83,9%-a monomer szarvasmarha proinzulin. Mindkét eluátumot liofilizáljuk. Az eluátum ILnek HPLPLC-vel történő vizsgálata megerősítette, hogy ez termékként szarvasmarha proinzulint tartalmaz. Igazolja ezt az állítást az is, ha ezt az irodalomból ismert eljárás alkalmazásával tripszinnci és karboxipeptidáz B-vel kezeljük, akkor szarvasmarha inzulint nyerünk. Az aminosav-analizis az alábbi eredményeket adta (összehasonlításként a természetes szarvasmarha inzulin és a természetes proinzulinból készített szarvasmarha inzulin analízisét is elvégéztük): Természetes inzulin Inzulin természetes proinzulinból Inzulin az előállított proinzulinból Alá 2,93 2,92 2,93 Asp 2,97 2,98 2,98 Thr 0,96 0,91 0,93 Ser 2,56 2,57 2,60 G lu 7,11 7,16 7,14 Pro 0,88 0,85 0,79 Gly 4,04 4,02 4,02 Vi Cys 5,47 5,00 5,45 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
