185249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-prekurzor előállítására
185 249 2 hogy a reagensek hozzáadása előtt a vizes közeget nitrogéngázzal átfúvatjuk, majd a gázt eltávolítjuk. Igen lényeges még, bár ez sem alapvető, hogy a találmány szerinti eljárást milyen hőmérsékleten végezzük. Az eljárást általában 0 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Előnyös, ha a reakcióhőmérséklet minél kisebb érték, általában 2 °C és 8 °C közötti, még előnyösebben 4 °C és 6 °C közötti érték. Ennél is előnyösebb, ha az eljárásnál két hőmérsékletértéket alkalmazunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten állítjuk elő, majd 2 °C és 8 °C közötti értékre lehűtjük és a hőmérsékletet a reakció ideje alatt ezen az értéken tartjuk. A jelen találmány szerinti eljárásnál tehát először előállítjuk a kiválasztott pH-jú vizes közeget, mely például körülbelül 0,05 n-nak megfelelő mennyiségű glicint tartalmaz. Az így előállított vizes közegből, melyet általában 0 °C és 37 °C közötti hőmérsékletértéken, előnyösen szobahőmérsékleten tartunk, a gázokat eltávolítjuk, azután nitrogéngázzal átfúvatjuk, majd újból gáztalanítást végzünk. Ezután a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzort feloldjuk a vizes közegben, mégpedig olyan mennyiségben, hogy annak koncentrációja például 0,1 mg/ml legyen, majd annyi merkaptánt adunk hozzá, hogy egy — S—S03 ionra legfeljebb öt —SH csoport jusson. Az így nyert reakcióelegyet, melyet lényegileg levegőtől vagy más oxidálószertől mentes körülmények között tartunk, lehűljük 4 °C és 6 °C közötti értékre és ezen a hőmérsékleten tartjuk addig, míg a reakció teljesen végbemegy. A reakció általában 5-72 óra alatt, rendszerint 15-24 óra alatt és szokásosan 18-20 óra alatt megy végbe. Miután a reakció reljesen végbement, az inzulin prekurzor terméket számos módszerrel izolálhatjuk, melyek jól ismertek és amelyek az inzulin tisztítására felhasználhatók. E célra leggyakrabban kromatográfiás eljárásokat, például gél-szűrést és ioncserélő kromatográfiai alkalmazunk. Az ily módon,előállított inzulin prekurzor vagy enzimatikusan vagy kémiai úton, az irodalomban leírt eljárások valamelyikével, inzulinná átalakítható. Ilyen eljárás például az, melynél a hasításra tripszin és karboxipeptidáz B kombinációját használják, ahogyan azt Kemmler és munkatársai, J. Biol. Chem. 246, 6786-6791 (1971) ismerteti. Az inzulin termék tisztasága és relatív aktivitása például poliakrilamid-gél elektroforézis, aminosav analízis, radioreceptor-vizsgálat, radioimmun-vizsgálat, nagyteljesítményű folyadék-kromatográfia (HPLC), ultraibolya spektrum, fajsúlytnérés, nyúl vércukorszint vizsgálat és más hasonló módszer alkalmazásával vizsgálható. A lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor kiindulási anyagok előállíthatok DNS rekombinációs módszerekkel, továbbá természetes inzulinokból és proinzulinokból, valamint számos ismert peptid-szintézissel is, így például oldat vagy szilárdfázisú technikák alkalmazásával. Egy lineáris láncú 3-szulfonát inzulin prekurzort proinzulinból az alábbiak szerint állítottunk elő: 100 ml hirtelen lehűtött, 7 molos karbamid-oldathoz hozzáadtunk 786 mg nátriumszulfitot és a teljes oldódásig kevertük. Ezután 594 mg nátriumtetrationátot adtunk hozzá és addig kevertük, míg a nátriumtetrationát legnagyobb része feloldódott, azonban az oldat így is zavaros volt. A pH-t jégecettel 7,7-re beállítottuk, majd keverés közben 503 mg HPLC szerint tiszta szarvasmarha proinzulint adtunk hozzá. Az oldat pH-ját 2 n nátriumhidroxiddal 7,6-ra állítottuk és az így nyert enyhén zavaros oldatot 6 °C hőmérsékleten 18 órán át kevertük. A reakcióelegynek körülbelül felét 2 n nátriumhidroxiddal kezeltük úgy, hogy a pH 9,1 legyen, majd Sephadex G-25 Coarse oszlopon kromatografáltuk. Á kromatográfiás reakciókörülmények a következők voltak: oldószer 0,05 mólos ammóniumhidrogénbikarbonát; pH 9,0; 2 x 90 cm-es oszlop; 21 °C-os reakcióhőmérséklet; 18,5 ml/perces átfolyási sebesség. Az eluátum első 120 ml-ét elöntöttük, a következő 75 ml-t egyesítettük és eltettük. Az oszlopot ezután további 400 ml 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonáttal (pH 9,0) mostuk. Ezt az eljárást a reakcióelegy másik felével megismételtük, A két eljárás során nyert eluátumokat, melyek az UV spektrum szerint összesen 401 mg anyagot tartalmaztak, egyesítettük és liofilizálással szárítottuk. Ily módon összesen 445,7 mg száraz sómentes terméket nyertünk. Cellulóz-acetát elektroforézissel és poliakrilamid gél-lemezes elektroforézissel igazoltuk, hogy a reakció során előállított termék a lineáris láncú S-szulfonát szarvasmarha proinzulin és kiindulási anyag már nem volt jelen. A lineáris láncú S-szulfonált szarvasmarha proinzulint DEAE cellulóz kromatográfiás eljárással tisztítottuk. A nyers mintát (443 mg) feloldottuk 7,5 mól karbamid-0,01 mól trísz 0,001 mól EDTA elegyben, a pH 8,5 volt, és az oldatot egy DEAE cellulóz oszlopra vittük fel. A kromatográfiás eljárást a következő reakciókörülmények között végeztük: az oldószer 7,5 mól karbamíd - 0,01 mól trisz - 0,001 mól EDTA; pH 8,5, 0-0,35 mól nátriumklorid grádienssel; oszlop mérete 2,5 x 90 cm; hőmérséklet 4 °C; átfolyási sebesség 0,9 ml/perc; frakciótérfogat 5,3 ml. 276 nm-néi megmértük az egyes frakciók abszorpcióképességét és ezt a frakciók számának függvényében ábrázolva egy enyhe lefutású görbét kaptunk, melynek egy nagy csúcsa (maximuma) volt. Az UV spektrumon lévő csúcs a terméket jelezte. Az 1069-1291 ml térfogatú, 199-240 frakciókat egyesítettük. Ez az UV spektrum szerint 355 mg terméket tartalmazott. A terméket tartalmazó eluátumot Sephadex G-25 Coarse oszlopon sómentesítettük. A kromatográfiás eljárás reakciókörülményei a következők voltak: oldószer 0,05 mól ammóniumhidrogénkarbonát; pH 8,0; oszlop mérete 3,7 x 10 cm; hőmérséklet 4 °C; átfolyási sebesség 16,0 ml/perc. Az eluátum első 395 ml-ét elöntöttük, a következő 250 ml-t összegyűjtöttük és eltettük. Az oszlopot ezután további 2000 ml 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonáttal mostuk (pH 8,0). Az eluátiunot, mely az U V spektroszkópiás vizsgálat szerint 321 mg anyagot tartalmazott, liofilizáltuk. Az ily módon nyert 373 mg vízmentes termék azonosságát poliakrilamid gél-lemezes elektroforézises vizsgálattal és az eluátumnak nagy teljesítményű kis nyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálatával igazoltuk. 5 10 10 20 25 30 35 40 4Í5 50 55 60 65 4
