185249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-prekurzor előállítására
1 185 249 2 A- és B-láncban (a) az A-6 és A-l 1-nél, (b) az A-7 és B-7-nél, illetve (c) az A-20 és B-19-nél lokalizált Cys csoportok kénatomjait kapcsolják össze, és (3) egy eltávolítható kapcsolódó csoportot tartalmaz, mely összeköti az inzulin A-láncot az inzulin B-lánccal, azaz az A-l amino-csoportot a B-29 helyen lévő lizin maradék -amino-csoportjával, vagy a B-30 helyen lévő aminosav maradék karboxil-csoportjával köti össze. Az inzulin prekurzor és a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor X kapcsolódó csoportja egy polipeptid. Az X csoport az A-lánchoz az A-l amino-csoportnál és a B-lánchoz a B-30 karboxicsoportnál kapcsolódik, és az egy inzulin prekurzor természetes kapcsolódó peptidje. Az inzulin általában az A- és B-lánc közül az egyikkel vagy mindkettővel jellemezhető. A természetes kapcsolódó peptidek a következők: Humán: -Arg-Arg-Glu-Ala-GIu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly- Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln- Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu- Gln-Lys-Arg- (III képlet). Sertés: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-GIn-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly- G ly- Leu-G ly-G ly- Leu-G In-Alá- Leu- Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys- Arg- (IV képlet). Szarvasmarha: -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro-Gln-Val-Gly-Ala-Leu-Glu-Leu-Aln-GIy-Gly-Pro-Gly-AIa-Gly-Gly-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg(V képlet). Az aminosav sorrend tehát az A-l-től A-21-íg, a B—1 -töl B-30-ig és az X csoportnál megegyezik a sertés, szarvasmarha vagy humán proinzulin, legelőnyösebben a humán proinzulin A-láncánál, kapcsolódó peptidjénél és a B-láncanál természetes úton kialakult aminosav sorrenddel. A találmány szerinti eljárás kivitelezésénél az egyenes láncú S-szulfonát inzulin prekurzort vizes közegben, 7 és 11,5 közötti pH-értéknél, egy merkaptánnal kezeljük. A merkaptán természetesen egy olyan vegyületet jelent, mely legalább egy—SH csoportot tartalmaz. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazható merkaptánnak vízoldhatónak keli lennie. Ilyen vizoldható merkaplánként ditiotreitol, ditioeritriol, 2-merkaptoetanol, metil-tioglikolát, 3-merkapto-l,2-propándiol és 3-merkapto-propionsav alkalmazható. Ezek közül igen előnyös a 2-merkaptoetanol. A találmány szerinti eljárás kivitelezésénél felhasznált vizes közeghez általában egy pulferoló szert adunk azért, hogy a kívánt pH-érték ne változzon. A közeg pH-ja 7 és 11,5 közötti érték lehet, de előnyösen a pH = 9,5-10,5. így a találmány szerinti eljárásban bármely olyan puflferoló szer alkalmazható, melynek puffer-kapacitása a fent említett tartományon belül van. Alkalmas pufferoló szerek például a foszfát pufierek, tri (hidroximetilj.aminomelán (Tris), borát pufierek, glicin és hasonlók. A vizes közegben a pufieroló szer koncentrációja általában legfeljebb 0,f n, előnyösen 0,005 n és 0,5 n közötti érték, még előnyösebben pedig 0,005 n és körülbelül 0,1 n közötti érték. A lineáris láncú S szulfonát inzulin prekurzor koncentrációja a vizes közegben legfeljebb 10 mg/ml. Előnyösen azonban i koncentráció alacsonyabb értek, általában 0,05 mg/ml és 2 mg/ml közötti érték. A jelen találmány szerinti eljárás egy fontos eleme a felhasznált merkaptánnak az egyenes láncú S-szulfonát inzulin prekurzorhoz viszonyított mennyisége. Az eddig alkalmazott módszereknél az S-szuífonátnak —SH-vá történő redukcióját az S-szulfonáthoz viszonyítva nagy feleslegben alkalmazott merkaptánnal végezték. Nyilvánvalóan ilyen nagy feleslegben alkalmazott merkaptán hatására az S-szulfonát kiindulási vegyület teljes mértékben a megfelelő —SH vegyületté redukálódott. Ez viszont szükségessé tette az —SH intermedier izolálását vagy a reakcióelegy nagymértékű felhígítását és ezután pedig az oxidációt, általában levegőn történő oxidációt azért, hogy az—SH vegyület a kívánt —S—S— vegyületté átalakuljon. Lásd például a Creslfield és munkatársai, J. Bioi. Chem. 238, 622-627 (1963); Steiner és munkatársai, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 60, 622-629 (1968); és Yanaihara és munkatársai Diabetes 27 (1. melléklet) 149-160(1978). A találmány szerinti eljárásnál kívánatos a merkaptánt olyan mennyiségben alkalmazni, hogy minden —S—S03 ionra 1-5 —SH csoport jusson és előnyösen olyan mennyiségben, melynél egy —SSO , ionra 2-^4—SH csoport jut. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a merkaptánt a fenti mennyiségben alkalmazva a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor direkt módon igen jó hatásfokkal és. könnyen átalakítható a kívánt diszulfid inzulin prekurzorrá. Mivel az inzulin A- és B-lánc, mely a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor részeként van jelen, ha S-szulfonát csoportot tartalmaz, így a merkaptánt, ha az csak egy —SH csoportot tartalmaz, természetesen olyan mennyiségben kell alkalmazni, hogy a mól arány 6 : 1 és 30 : 1 értékek között legyen. Mivel a pH-érték a puffer erőssége és a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor koncentráció értéke lényeges, bár nem alapvető, a reakció kivitelezésénél ezeket kell figyelembevenni. Általában előnyös a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzor koncentrációjának növelésével a pH-értéket növelni és a puffer erősségét csökkenteni. Teljesen eltérően az irodalomban eddig ismertetett eljárásoktól, a találmány szerinti eljárásnál nem alapvetően lényeges, hogy azt valamely oxidáló atmoszférában végezzük. Bár egy oxidálószer, például levegő, a reakcióközegben jelen lehet, vizsgálataink azt mutatták, hogy előnyös a reakció kivitelezését lényegileg levegő- vagy más oxidálószertől mentes körülmények között végezni. A „lényegileg mentes” kifejezés csak azt jelenti, hogy levegő-hozzáadást kerülni kell. Ezt például elérhetjük oly módon, hogy a reakciót zárt rendszerben végezzük és igy megakadályozzuk azt, hogy a levegő vagy más oxidálószer rendelkezésre álljon. Továbbá a levegőmentes közeget úgy is biztosíthatjuk, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
