185249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-prekurzor előállítására
i 85 249 2 Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu- Ala-Leu-Glu-Giy-Pro-Pro-Gln-Lys- Arg- (IV képlet). Szarvasmarha:-Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro-Gin-Val-Gly-Ala-Leu-Glu-Leu-Aln-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg(V képlet). A találmány tárgya eljárás új inzulin prekurzorok előállítására. Az utóbbi években sokan próbálkoztak az inzulin szintetikus vagy fél-szintetikus úton való előállításával. Az inzulin molekula két pepiid láncot tartalmaz, az A-láncot, mely 21 aminosav maradékból és a B-láncot, mely 30 aminosav maradékból áll. Ezek a láncok három diszulfid hidat tartalmaznak, melyek mindegyike két-két ciszteinil maradékot köt össze. Két diszulfid híd kapcsolja az A-láncot a B-lánchoz. A cisztein maradékokat összekötő hidak az A-6 és B-19 helyen vannak. Egy általános eljárás szerint az inzulint proinzulínból vagy egy proinzulinhoz hasonló molekulából állítják elő. Proinzulin egy olyan egyes polipeptid lánc, amelyben az inzulin A-lánc N-terminális része egy pepiiden keresztül kapcsolódik az inzulin B-lánc C-terminális részéhez és a megfelelő cisztein maradékok diszulfid kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz. Human proinzulinnál, például amelyik 86 aminosav maradékból áll, a kapcsolódó peplidlánc 35 tagból áll. Yanaihara és munkatársai., Diabetes 27 (Pót). 1) 149-160 (1978) egy kapcsolódó peptidlánc és human proinzulin szintézisét ismerteti. Az irodalomban más proinzulin-szerü molekulákat is leírtak, melyek a proinzulintól főleg a következőkben térnek el: más az inzulin A- és B-láncot összekötő csoport struktúrája és ez. a csoport a lánc más pontjait kapcsolja össze. így, Busse és munkatársai., Biochemistry 15. 8, 1649-1657 (1976) egy olyan kapcsolódást ismertet, ahol két metionil maradék az N-terminális részhez egy karbonilcsoporttal kötődik és a maradék az A-l glicil N-terminális részhez és a B 29 lysil N-terminális részhez kötődik. Hasonlóképpen, más kapcsolódó csoportok is ismeretesek. Lásd például, Geiger és munkatársai., Biochem., and Biophys, Res. Comm. 55, 60-66 (1973); Brandenburg és munkatársai., Hoppe- Seyler’s Z. Physiol. Chem. 354, 613 -627 (1973); 3 847 893, 3 907 763, 3 883496, 3 883 500 és 3 884 897 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást. Ha az inzulint egy meghatározott csoporttal öszszekötött inzulin A- és inzulin B-láncból álló egyes láncból állítjuk elő, akkor az inzulin A- és B-lánc közötti direkt kapcsolódást úgy kell létrehozni, hogy az A- és B-láncon lévő hat cisztein maradékot 3 diszulfid híd kösse össze. A diszulfid kötés kialakítása után pedig az eredeti összekötő csoportot az inzulin képzéssel el kell távolítani. Az inzulin előállításakor kívánatos, hogy megfelelő diszulfid hidak kialakítása egy hatásos és könynyen elvégezhető eljárással történjen. Az irodalomban általában a diszulfid hidak kialakítására olyan módszereket írnak le, melyek során a megfelelő —SH struktúrákat levegőn történő oxidációnak vetik alá. Továbbá, az — SH struktúra instabilitása miatt a prekurzort szokásosan egy S-védőcsoporttál, jellegzetesen egy S-szulfonáttal (—S—S03 ) képzik. így az irodalomból ismert eljárások két egymás után következő műveletet foglalnak magukba, mégpedig az S-szulfonátnak egy merkaptánnal való kezelés során—SH-vá történő redukcióját és az ily módon nyert —SH vegyületnek levegő-oxidációját. Kísérleteink“ során kidolgoztunk egy könnyen elvégezhető és igen hatásos eljárást az S-szulfonátnak a kívánt diszulfid inzulin prekurzorrá történő közvetlen átalakítására, mely eljárás nem redukción, illetve oxidáción alapul. Ez a direkt átalakítás olyan reakciókörülmények között hatásos, melynél, bár nem alapvető, oxidálószer nincs jelen. Ez az eljárás az, melyre a jelen találmány vonatkozik. Dixon és munkatársai., Nature 188, 721-724 (1960) a szokásosan alkalmazott két műveletből álló eljárás helyett egy más típusú eljárást ír le, melynél az inzulin A- és B-lánc egyesítését és nem a lineáris láncú S-szulfonát inzulin prekurzorból a diszulfid képzést alkalmazzák. Az eljárás szerint az A- és B-láncú S-szulfonátokat egy oldatban egyesítik. A leírás azonban az eljárást csak vázlatosan ismerteti, és a kitermelés, mely a visszanyert termék aktivitásán alapul, csak 1-2%. Egy későbbi publikáció, Dixon, Proc. Intern. Congr. Endocrinal. 2, London, 1964, 1207-1215 (1965), kissé részletesebben ismerteti az eljárást (a IV. táblázatban és a 1211. oldalon), mely két műveletből áll, mégpedig egy anaerob S-szulfonát redukcióból és az ezt követő oxidációból, és ily módon a kívánt diszulfid terméket állítják elő. A jelen találmány tárgya eljárás I általános képletü inzulin prekurzor előállítására, ahol a képletben Y jelentése -Lys-Ala- vagy -Lys-Thr, A 2Hg &yök jelentése egy inzulin A-lánc; B ^ő'fg §y°k jelentése egy inzulin B-lánc; és X jelentése 111 képletű humán peptidszekvencia, IV képletű sertés peptidszekvencía vagy V képletű borin peptidszekvencia, mely eljárás során egy II általános képletű S-szulfonátot, ahol a képletben X és Y, valamint az A-I-től A-21-ig és B-í-től B-30-ig gyök jelentése a fenti, vizes közegben, 7 és 11,5 közötti pH-értéknél, és ahol az S-szulfonát koncentrációja legfeljebb 10 mg/ml, 2-merkaptoetanollal, ditiotreitollal, ditioeritriolial, metil-tíoglikolátlal, 3-merkapto-l,2-propándiollal vagy 3-merkapto-propionsavva! reagáltatjuk, és a merkaptánt olyan mennyiségben alkalmazzuk, melynél egy—SS03-ionra 1-5—SH csoport jut. A jelen munkában használt „inzulin prekurzor” kifejezés egy olyan molekulát jelent, amely (1) egy inzulin A-láncot és egy inzulin B-láncot tartalmaz, (2) legalább három diszulfid kötése van, és ezek az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 65 2
