185230. lajstromszámú szabadalom • Eljárás farmakológiailag hatásos enkefalin-analóg peptidek előállítására
1 2 ië ml) oldunk és N-metil-morfolint (1,99 ml; 17,9 miilimól), majd izobutil-klór-formiátot (2,34 ml; 17,9 millimól) adunk hozzá. 2,5 perc múlva ammóniagázt vezetünk be a reakciókeverékbe 1 órán keresztül. A reakciókeveréket összerázzuk 80 ml etilacetáttal és 80 ml vízzel és a rétegeket szétválasztjuk. Az etil-acetátos réteget egymás után 1 n kálium-hidrogén-karbonáttal (80 ml), vízzel (80 ml), 1 n sósavoldattal (2x80 ml) és vízzel (80 ml) mossuk. Az etil-acetátos fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és szűrjük, és a szűrletet vákuumban bepároljuk, A kapott 4,77 g fehér szilárd anyagot etil-acetát/petroléter egyből átkristályosítva a címben megnevezett vegyülethez jutunk (3,32 g; 66%). B. L-p-Metoxi-fenilglicin-amid. hidrokloridsó A fenti A. részben előállított 3,32 g (12 millimól) vegyületet jégecet (6,0 mi), anizol (4,7 ml) és trietilszilán (4,7 ml) elegyében oldjuk és hozzáadunk 47 ml (36 millimól) 0,77 n ecetsavas sósavoldatot A reakciókeveréket szobahőmérsékleten 35 percig keverjük kalcium-szulfát szárítócső alatt, majd a keveréket 60 ml éterrel hígítjuk. A képződött csapadékot leszűrjük, kétszer éterrel (50 ml) mossuk és vákuumban szárítva 2,53 g címben megnevezett terméket kapunk (75%). C. N^-terc-Butoxi-karbonil-L-fenilalanil-L-p' metoxi-fenilglicin-amid A B. részben kapott 650 mg (3,0 millimól) termék és DMF (6 ml) lehűtött (0 °C) szuszpenziójához 0,52 ml (3,0 miUitnól) DIEA-t, 811 mg (6,0 millimól) HBT-t, 4 ml DMF-ban oldott 786 mg (3,9 millimól) Boc-L-femilalamint és 2,5 ml DMF-ban oldott 619 mg (3,0 millimól) DCC-t adunk. A reakciókeveréket 0 °C-on 2,5 óráig keverjük kalciumszulfát szárítócső alatt, majd szobahőmérséklete*; 16 óráig keverjük. A reakciókeverékből a diciklohexil-karbamidot (DCU) szűréssel eltávolítjuk és a szűrletet vákuumban bepárolva sárga sűrű szuszpenziót kapunk, melyet összerázunk 200 ml etiiacetáttal és 100 ml vízzel. A rétegeket szétválasztjuk és az etil-acetátos réteget egymás után 100 m! vízzel, háromszor 400 ml pH 10-es pufferrel, 3 x 400 ml 0,1 n sósavoldattal és háromszor 400 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátot vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk és leszűrjük, és az oldószert vákuumban lepárolva 1,27 g (99%) címben megnevezett vegyületet kapunk fehér szilárd alakban. D. L-Fenilalanil-L-p-metoxi-fenilglicin-amidhidrokloridsó A C. részben kapott 1,27 g (3,0 millimól) termék 4 ml jégecettel, 1,0 ml anizollal és 1,0 ml trietiiszilánnal készült oldatához 10 ml (15,8 millimól) ecetsavval készült 1,58 n sósavoldatot adunk. Az oldatot kalcium-szulfát szárítócső alatt 45 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd 250 ml éterrel hígítjuk. A kapott csapadékot leszűrjük, kétszer 15 ml éterrel mossuk és vákumban 35 °C-on szárítva 1,01 g (92%) címben megnevezett vegyületet kapunk. E. Na-!erc-Butoxi~karbonU-L-!irozil-D-alanilglicil-L-fenilalanil-L-p-metoxi-fenilglicm-amid A D. részben kapott 1,01 g (2,36 millimól) termék és 15 ml DMF hideg (0 °C) szuszpenziójához 640 mg (4,72 millimól) HBT-t, 10 ml DMF-ban 30 szuszpendált 1,29 g (2,36 millimól) N°-fm:-butoxikarbonil-L-tirozi'-D-alanil-glicint és 2 ml DMF- ban oldott 490 mg (2,38 millimól) DCC-t adunk. A reakciókeveréket olvadó jégfürdőben 18 óráig keverjük és a DCU-t szűréssel eltávolítjuk. A szűrletet vákuumban bepárolva sárga maradékot kapunk, melyet összerázunk 200 ml etil-acetáttal és 200 ml vízzel. A rétegeket elválasztjuk és az etilacetátot egymás után háromszor 500 ml pH 10-es pufferrel, háromszor 500 ml 0,1 n sósavoldattal és háromszor 500 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos réteget vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és leszűrjük, és az oldószert vákuumban eltávolítva 1,93 g (> 100%) címben megnevezett vegyületet kapunk. Ez vékonyrétegkromatográfia (TLC) alapján szennyezésként DCU-t tartalmaz. Az anyagot a következő műveletben további tisztítás nélkül dolgozzuk fel. F. L-Tirozil~D~aIanil-g!icil-L-fenilalanil-L-pmetoxi-fenilglicinamid-írifluor-acetát Az E. részben kapott 1,69 g (2,35 millimól) terméket 3,0 ml anizolban és 3,0 ml trietil-szilánban szuszpendáljuk és hozzáadunk 30 ml trifluor-ecetsavat. A kapott tiszta, sárga oldatot kalcium-szulfát alatt 45 percig keverjük, majd vákuumban bepárolva sárga olajat kapunk. Az olajat eldörzsöljük 1,5 liter éterrel, a csapadékot szűréssel összegyűjtjük, kétszer 20 ml éterrel mossuk és 35 'C-on vákuumban megszárítva 1,73 g (87%) DCU-szennyezéstől mentes, címben megnevezett vegyületet kapunk. G. Kromatográfiás tisztítás L- iirozil-ö-alaniíglicU-L-fenilalanil- L-p-metoxi-fenilglicm-ar,íidacetát előállítására Az F. rész termékét (1,50 g, 2,05 milíffitói) 5,15.105 N/m2 nyomás alatt C18-sziíikagéloszkspon (5 x 72 cm) kromatrografáljuk 27%-os aeeíonitriî/0,1 n ammónium-acetát eluenssel. Az oszlop efiluensét 280 nm en mért abszorpciója alapján ellenőrizzük és 1122 ml eluátum nyerése, után a további eluátumból 15,9 ml-es frakciókat gyűjtünk,, egyenként 1 'A perc alatt. 33-75. fakciókat egyesítve és liofilizálva fehér szilárd anyagot kapunk. A szilárd anyagot a maradék pufTersóktól Sephadex G Í0 oszlopon kroniatografálva választjuk el, eluensként 50%-os ecetsavat használva. Az eluátumot 280 nm-en mért abszorpciójával ellenőrizzük és 6 perces (8,4 ml) frakciókat szedünk. A 27-46. frakciókat egyesítve és liofiiizálva 1,12 g (75%) címben megnevezett vegyületet kapunk. [a]” = +95,59° (c = 0,5; 1 n sósavoldat) [aj* = + 384,22° (c = 0,5; 1 n sósavoldat) Elemi analizis a C34H42N609 (678,743) összegképlet alapján: C H N Számított 60,17 6,24 12,38 talált 60,41 6,03 12,61 Aminosav-analízis: 1,02 Gly; 1,00 Alá; 1,02 Tyr; 0,98 Phe; l,04p-(MeO)Pgl*; l,05NH3;98%peptid. * Egy része az elemzés alatt p-hidroxi-femilglicinné és mint ilyent elemezzük, 5 5 10 lg 2ü 26 3C 35 40 45 50 55 6C 65 6
