185223. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztreptokináz és plazminogén biner komplexét tartalmazó enzimszármazék előállítására
p-metoxi-benzoesav-p-amidino-fenil-észtert adunk. Enyhe zavarosodás keletkezik. Az elegyhez 0,5 ml emberi lys-plazminogent elegyítünk (8,99 mg/ml a fenti pufferben) (Kabi, Stockholm) és az oldatot gyorsan és alaposan összekeverjük. 15 perces jéggel történő hűtés után az oldatot további felhasználásig jégen tartjuk. Kb. 2 ó.ra múlva az anyag 0,4 ml-ét (40 000 egység) 3 ml L-lizin-Sepharose 4B szuszpenzióval hígítjuk (a szuszpenzió a fenti pulíerben 33 súly/tf%-os) és 1 óráig 0 °C-on tartjuk. A kapott gélt zsugorított üvegtölcséren leszűrjük 4 °C-on, majd szívással szárítjuk és 100 ml pufferoldattal mossuk. A gélt enyhe szívás mellett eluáljuk ugyanazzal a pufferoldattal, amely 0,1 mól e-aminokapronsavat tartalmaz (5 mFëFl részben). Az egyesített szürleteket 2 óráig 4 °C-on dializáljuk ammónium-hidrogén-karbonál púderrel (50 mmól/l, pH 7,0) amely 2,5 súly/tf% mannitolt tartalmaz. A terméket ezután liofilezzük és így 0,799 gramm fehér anyagot kapunk. A termék kb. 195 mg-ját ezután meganalizáljuk poli-akrilamid gél rétegen történő elektroforezissel, melyhez 10 súly/tf% gélt használunk nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében. Két fő polipeptid sávot figyelhetünk meg, mely a lys-plazminogénnek (molekulasúly 84000) és sztreplokináznak (molekulasúly 47000) felel meg. Nyomokban emberi szérum albumin származék is található, mely a kereskedelmi sztreptokináz készítményből származik. 2. példa:. P-anizoil-(sztreptokináz-plazminogén) aktiválnikomplexet tartalmazó liofilezett gyógyászati készítmény előállítása 7,5 pH-jú, 0,03 mól nátrium-foszfát és 0,12 mólos nálrium-glutamát pufferben oidolt 9,95 mg/ml töménységű sztreptokinázoldatból 45,4 ml-t elegyítünk lizin/mennit puffer 110 ml-ével 7,0 pH mellett és 60 ml steril glicerint adunk hozzá, majd az elegyet 4 °C-on 5 percig keverjük. Ezután 15 ml (20 mmól/ 1-es DMSO-oldatban oldott) p-metoxi-benzoesavp-amidino-fenil-észler szűrt steril oldatát adjuk hozzá két perc leforgása alatt és az elegyet 4 °C-on 5 percig keverjük. 71 ml 11,4 mg/ml töménységű emberi !ys-plazminogénl adunk hozzá (Kabi, Stockholm) 2 perc leforgása alatt és az elegyet 4 °C-on 60 percig keverjük. Ezután 18,9 ml (20 súly/tf%-os) emberi szérum albumint (klinikai minőségű) adunk az elegyhez, majd az egészet 4 °C-on 2 percig keverjük. A reakcióelegyet tartalmazó edény tartalmát 400 ml-re egészítjük ki lizin/mannit puffer oldat hozzáadásával, a folyadékot ezután 2,5 óráig 18 °C-on diafiltráljuk, míg 2400 ml szőriét gyűlik össze. A kapott folyadékot ezután 14 cm átmérőjű, 0,22 pm porozitású steril Millipore szűrön szűrjük (megfelelő előszűrés után) és steril edényben összegyűjtjük. A szürletből 5 ml-es aliquot részeket gyorsan 20 ml-es steril liofilező edényekbe töltjük (tiszta üveg) és dupla fedéllel látjuk el, majd az edényeket liofilező polcokon — 40 'C-on fagyasztjuk. A lioíilczés legalább 24 óráig tart, majd ezután a sapkákat steril nitrogén atmoszférában felhelyezzük, és légmentesen lezárjuk. Az egyes fiolák tartalma a következő: p-anizoil-( sztreptokináz-plazminogén) aktivátorkomplex: 4-6 mg L lizin.HCI: 22,8 mg D-mannit: 50 mg p-metoxi-benzoesav-p-amidino-fenil-észter: < 50 hí? nálrium-klorid: nyomokban 3. példa Az 1. példában leírtak szerint 3-meti!-4-metoxibenzoil-(sztreptokináz-plazminogén) aktivátor komplexet készítünk. Az ott szereplő p-metoxibcnzoesav-p-amidino-fenil-észter helyett most 3- melil-4-meloxi-benzoesav-p-amidino-fenil-észtert használunk. 4. példa A belső peptidkötés felhasadása nélkül liofilezett 3,5-dimetil-4-metoxi-benzail-sztreptokinózlplazmi~ nogén komplex előállítása 7,5-es pH-jú, 0,03 mól nátrium-foszfát és 0,12 mól nálrium-glutamát tartalmú pufferben oldott 3,58 mg/ ml töménységű sztreptokináz oldatból 20 ml-t elegyítünk 20 ml glicerinnel és az elegyet 4 °C- on 5 percig keverjük. 4-metoxi-benzoesav-pamidino-fenil-észter hidroklorid sójából 21,7 mg-ot feloldunk 3 ml dimetil-szulfoxidban és az oldatot az előzőhöz hozzáadjuk;. A kapott elegyet 4 °C-on 5 percig keverjük. 25 ml 144 mg humán lys-plazminogént tartalmazó oldatot. (20 mmól/l L-lizin.HCi, 1 súly/tPn-os D-mannit. pH = 7,0) adunk az előzőhöz és az elegyet 4 °C-on 2 óráig keverjük. 3 ml (vízben 20 súly/tf%-os) humán szérum albumint adunk hozzá és az elegyet 250 ml-re hígítjuk lizin/ mamiit pufferrel, majd az oldatot 2,5 óráig 4 °C-on diafiltráljuk, amíg 1130 ml szürletet kapunk. Az oldatot lioíilizálva 3,018 gramm fehér port kapunk, melynek deacetilezés után a szabadaktivátor-tartalma kb. 23,5 pg/mg. Biológiai adatok Az 1., 2. és 3. példa szerint készített származékokat összehasonlítottuk az ismert „sztreptokináz/ humán-plazminogén komplex” származékokkal, melyek a 79 301 773.2 számú Európai szabadalmi bejelentésben leírtak szerint lettek előállítva és a nem módosított szlreptokináz-plazminogér. aktivátor komplexszel. Az összehasonlítás során mindegyik vegyiiletel rendszeresen adagoltuk nyulaknak, melyeknek felső vénakávájában radioaktív módszerrel jelzett vérrög helyezkedett el. Ugyanazt a módszert használtuk, mint amit a fent említett európai szabadalmi bejelentésben leírtak, kivéve, hogy a trombust egy gyapjú szállal rögzítettük helyhez és nem az ér lekötésével. Az átlagos oldódási viszonyokat a különböző állat-csoportoknál meghatároztuk és az eredményeket az 1. táblázatban rögzítettük (16. oldal). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
