185158. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11béta-szubsztituált szteroidszármazékok előállítására
1 Ï85 ! 58 2 A homogenátumot ezután 105.000 g -vei centrifugáljuk 95 percig, 0 °C-on. Az így kapott felül elhelyezkedő folyadék alikvot részeit inkubáljuk 0 °C-on konstans koncentrációjú (T) triciált dexametazonnal növekvő koncentrációjú (0-2500X10-9 mól/,,hideg’5 (inaktív) dexametazon, vagy a „hideg” vizsgálandó termék jelenlétében. Ezután megmérjük a kötött, triciált dexametazon koncentrációját (B) az összes inkubátumban, a csontszén-dextránhoz történő adszorpció módszerével. Egér uteruszának ösztrogén-receptora 18—21 napos, nemileg éretlen nőstény egereket feláldozunk. Az uteruszaikat eltávolítjuk, majd 0 °C-on egy' Potter-féle politetrafluor-etilén-edény felhasználásával homogenizáljuk egy TS pufferoldatban (10 mmól Tris, 0,25 mól saccharóz és HCI, pH = 7,4). (1 g szövethez, 25 mi TS puffert adunk). A homogenátumot ezután 105.000 g-vel ultracentrifugáljuk 90 percig, 0 °C-on. Az így kapott felül elhelyezkedő folyadékból alikvot részeket inkubálunk 0 °C-on (t) ideig, konstans koncentrációjú (T) triciált ösztradiollal és növekvő koncentrációjú (0-1000X10-9 mól) inaktív ösztradiol vagy az inaktív vizsgálandó termék jelenlétében. A kötött, triciált ösztradiol koncentrációját (B) ezután megmérjük az összes inkubátumban a csontszén-dextránhoz történő adszorpciós technikával. A kötés relatív affinitásának kiszámítása A kötés relatív affinitásának (RAB) kiszámítása az összes receptornál azonos. 5 A következő két görbét vizsgáljuk: a kötött, triciált hormon B/T arányát a „hideg” referencia-hormonkcncentráció logaritmusának függvényében, és a B/T arányt a „hideg” vizsgálandó termék koncentráció logaritmusának a függvényében. 1 ci A I50 = (B/T max + B/T min)/2 egyenlet egyenes szakaszát meghatároztuk. B/T max = A (T) koncentrációban jelenlevő triciált hormonból egy inkubáció alkalmával megkötött triciált hormon százalékos aránya. 15 B/T min = a triciált hormon százaléka, ami egy inkubáció alatt megkötődik ugyanazon (T) koncentrációban jelenlevő triciált hormonból, nagy feleslegben jelenlevő „hideg” hormon esetében (2.500X 10~9 mól). Az Iso vonal és a görbék metszéséből kiszámíthatjuk a 20 „hideg” referencia-hormonkoncentrációt (CH) és a „hideg” vizsgált termék koncentrációit (CX), amelyek 50 %-kal csökkentik a triciált hormonnak a receptorhoz való kötődését. A vizsgált termék kötődésének relatív affinitását 25 (RAB) a következő egyenlettel határozzuk meg: RAB = 100.TM. (CX) 30 A kapott eredmények a következők: Példa szerinti termék Inkubációs periódus 0 °C-on Mineralokortikoid Androgén Progeszteron Glukokortikoid Ösztrogén 4 0 -20 74 -640 270 265 0 __ _ _ 17 0 -68 81 -351 279 235 0 — — 14 — — — — 0 41 -250 46 94 0 — 8 0 -14,7 81 -268 212 167 0 ~ — 10- 0 -12 78 -467 254 292 0 — — 11- - 0 -9,8 6,3 -8,3 9 14 0 — • — 16- - 1,7 -29 129 -166- 283 259 0 — — 12 0 -2,8 0,6 -0,4 5,3 6,2 0 _ 6 0,8 -7,3 10 -4,3 171 118 0 — — 20 —. — — — 2,2 1,1 -2,5 7,8 5 0 — — 22- - 0,3 -8 175 -843 178 221 0 — — 29- - 0 -- 4,6 15,2 -38- 79 104 0 — — 24
