185022. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív tetrapeptid-származékok előállítására
1 2 185.022 Ice verj ük, majd hozzáadunk 5 ml ecetsavat, és 10 ml etil-alkoholt. A kész elegyet 200 g darabos jégre öntjük, és a vizes elegy pH-ját 1 n kálium-hidroxid-oldattal 10-11 -re állítjuk, majd dietil-éterrel kétszer kirázzuk. Ezután a vizes részt pH-ját hideg citromsav-oldattal 3,0-ra állítjuk, majd dietil-éterrel háromszor kirázzuk. A szerves részt vízzel kétszer kimossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk dietil-éterben, és az oldathoz hozzáadunk 3,22 ml (0,025 mól) d-{+)-a-metil-benzil-amint. Az elegyhez petrolétert adunk, és a kikristályosodó csapadékot kiszűrjük és megszárítjuk. Ily módon 11,59 g (hozam : 91%) cím szerinti vegyületet kapunk, op-126-128 °C. [a]2Q = -31,4° (c = 1, kloroform). Analízis a C^0HtoN->ü<- (506,6) képlet alapján: számított: C:71 H: 7,56%, N: 5,53%, . talált: C: 71,38%, H: 7,33%, N: 5,71%. b) lépés N-tercier-butoxi-karbonil-N^metil-L-tirozil-D-alanin 30 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 2,73 g (7,1 mmól) IS^-tercier-butoxi-karbonil-N^metil-O-benzil-L-tirozint (amelyet 3,6 g, az a) lépésben leírt módon nyert termékből savanyítás és dietil-éteres kirázás útján nyerünk), majd az oldathoz 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk 2,36 g (7,1 mmól) D-alanin-benzil-észter, p toluol-szulfonsavas sót, és utána 0,794 g (7,1 mmól) trietilén-diamint. Az elegyet 5 percig 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 0,96 g 1-hidroxi-benzotriazolt és 1,46 g (7,1 mmól)diciklohexil-karbodümidet. A reakcióelegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 0 °C hőmérsékleten hűtjük, a csapadékot kiszűrjük, és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk etil-acetátban, és az oldatot 1 n vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, ezután 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk, és vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradék olajat feloldjuk 60 ml etanolban, és az oldathoz vizes szuszpenzió formájában hozzáadunk 1,5 g 5%-os csontszenes palládium katalizátort. A reakcióedényt nitrogénnel átöblítjük, majd az elegyet 24 órán át hidrogénezzük. Ezután az edényt megint nitrogénnel átöblítjük, a katalizátort kiszűrjük, és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon amorf, szilárd anyag formájában 2,5 g (hozam: 99%) cím szerinti vegyületet kapunk. D = -54,11° (c * 0,5, metanol). Analízts a C. oH%N->Oc (366) képlet alapján: számított: C:39P0%; H: 7,15%, N: 7,65%, talált : C : 63,30%, H: 7,65%, N : 8,51%. c) lépés N^tercier-butoxi-karbonil-N1 -metil-L-tirozil-D-alanil-glicil-L-(Nú-ctil)-p-fluor-fenil-alanin-arnid 15 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,1 b (2,99 mmól) Na-tercier-butoxi-karbonil-glicil-L-(N“-etiy-p-fluor-fenil-aIanin-amidot, az elegyet fél órán át 0 C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson melegítés nélkül ledesztilláljuk. Az olajos maradékhoz dietil-étert adunk, majd az oldószert leöntjük, és a maradék olajat csökkentett nyomáson megszárítjuk. 5 ml dimetil-forma-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 midhoz hozzáadunk 1,09 g (2,99 mmól), a b) lépésben leírt módon nyert terméket. Az oldathoz -15 °C hőmérsékleten, keverés közben gyorsan hozzáadunk 0,3 ml (2,99mmól) N-metil-morfolint és 0,39 ml (2,00 mmól) klórhangyasav-izobutil-észtert. Az elegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keverjük, miközben elkészítjük az alábbi elegyet: A fent leírt módon elkészített dipeptid-trifluor-ecetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,3 ml N-metil-morfolint. A reakció teljessé tétele érdekében az oldatot keverjük. Ezt az elegyet egyszerre hozzáadjuk a vegyes anhidrid fent leírt módon elkészített oldatához, és a reakcióelegyet 4 órán át -15 °C hőmérsékleten keverjük. Utána jeges 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, és a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. A szerves részt elválasztjuk, vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, majd megint vízzel mossuk, és vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, ily módon 2 g olajos terméket kapunk. Ezt az olajos terméket feloldjuk acetonban, és az oldatot felvisszük három preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre. A lemezeket kloroform és metanol 9:1 arányú elegyében futtatjuk, a fő komponenst tartalmazó szilikagélt lekaparjuk, és a terméket leoldjuk róla. Ily módon 1,3 g (hozam: 71%) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]25^ = -76,8° (c = 0,5, metanol). Analízis a Ci.H942NcÓ7 (615,7)képlet alapján: számított: C:60,47%/H: 6,88%, N: 11,37%, talált : C: 60,27%, H: 6,61%, N: 11,14%. d) lépés L-N -metil-tirozil-D-alanil-glicil-L-(Na-etil)-p-fluor--fenil-alanin-amid, ecetsavas só . 15 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,1 g (1,78 mmól), a c) lépésben leírt módon előállított terméket, Az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot puffer-oldatban (amely 1% piridint és 0,05% exetsavat tartalmaz) 10 ml térfogatra oldjuk, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, acetát-formában lévő Sephandex DEAE A-25-tel töltött oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezzel a puffer-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a fenti puffer-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nmnél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot feloldjuk 10 ml 0,2 n ecetsav-oldatban, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, 0,2 n ecetsav-oldattal egyensúlyba hozott Sephandex G-10-zel töltött oszlopra. Az oszlopot 0,2 n ecetsav-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 0,801 g (hozam: 78%) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]2 d = -1,57° (c = 0,5 In sósav). Analízis a C^oHioNrO^F (575,64) képlet alapján: számított:C:58,42%,Tí:6,65%,N: 12,17%, talált: C: 58,67%, H: 6,40%, N: 12,42%. Aminosav-analízis: Alá: 0,99, Gly: 1,01, NH^: 0,96. Az I általános képletű vegyületek fájdalomcsillapító hatását egéren hot-plate (fűtőtapos)-módszerrel mutatjuk ki. E célból a kísérleti állatot egy függőlegesen álló, plexiüvegből készült hengerbe helyezzük, amelynek alaplapjaegy 52 °C hőmérsékletre felmelegített fűtőlap. Az egereknek orálisan vagy szubku-8
