185022. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív tetrapeptid-származékok előállítására
1 2 likagéllel (Grace és Davison, grade 62) töltött oszlopra. Az oszlopot kloroformmal, majd 5%-ig növekvő mennyiségű metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk, és a terméket vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel azonosítjuk. A megfelelő frakciókat egyesítve 2,9 g (hozam: 69%) cím szerinti vegyületet kapunk, [ar n = -93X (c = 0,5, metanol). Analízis a C, RfWhU04F (367,4) képlet alapján: számított :CT:38%%, H: 7,13%, N: 11,44%, talált: C : 58,74%, H: 7,24%, N: 11,13%. b) lépés N^-tercier-butoxi-karbonil-L-triazol-D-treonil-glicil-L^b^-etiO-p-fluor-feml-alanin-amid 20 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,47 g (4 mmól), az a) lépésben leírt módon nyert terméket. Az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztilláljuk. Az olajos maradékhoz dietil-étert adunk, majd az oldószert leöntjük, és a maradék olajat csökkentett nyomáson megszárítjuk. 1,6 g (4 mmól) Na-tercier-butoxi-karbonil-D-treonin, diciklohexil-amin-sót feloldunk etil-acetát és 1,5 n citromsav-oldat kétfáziú elegyében. Az etil-acetátos részt elválasztjuk, vízzel egyszer mossuk, magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, az oldatot -15 °C hőmérsékletre hütjük, és keverés közben gyorsan hozzáadunk 0,44 ml (4 mmól) N-metil-morfolin, és 0,53 ml (4 mmól) klórhangyasav-izobutil-észtert. Az elegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keverjük, miközben elkészítjük az alábbi elegyet: Az első bekezdésben leírt módon előállított dipeptid-trifluor-ecetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,44 ml N-metil-morfolint. A reakció teljessé tétele érdekében az oldatot keverjük. Ezt a keveréket gyorsan hozzáadjuk a fenti bekezdésben leírt módon elkészített vegyes anhidrid-oldathoz, és a reakcióelegyet 4 órán át keverjük. Utána jeges In nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, és a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. A szerves részt vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradék súlya: 1,6 g. A fenti olajos maradékból 1,5 g-ot (3,21 mmól) feloldunk 1 5 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyében. A reakcióelegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztilláljuk. Az olajos maradékhoz dietil-étert adunk, és a kapott csapadékot kiszűrjük és csökkentett nyomáson megszárítjuk. 902 mg (3,21 mmól) Na-tercier-butoxi-karbonil-L-tirozint feloldunk 5 ml dimetil-formamidban, és az oldathoz -15 °C hőmérsékleten, keverés közben gyorsan hozzáadunk 0,35 ml (3,21 mmól) N-metil-morfolint, és 0,42 ml (3,21 mmól) klórhangyasav-izobutii-észtert. A reakcióelegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keverjük, miközben elkészítjük az alábbi elegyet. A fenti leírt módon elkészített tripeptid-trifluor-ccetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és az oldahoz 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,35 ml N-metil-morfolin. A reakció teljessé tétele érdekében az elegyet keverjük. Ezután ezt az elegyet hozzáadjuk az előző bekezdésben leírt módon elkészített vegyes anhidrid oldatához, és a reakcióelegyet 4 órán át -15 °C hőmérsékleten, majd éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 1 n jeges nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, és a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. A szerves részt elválasztjuk, vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk acetonban, és az oldatot felvisszük három preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre. A lemezeket kloroform és metanol 9:1 aránú elegyében futtatjuk, a fő komponenst tartalmazó szilikagélt lekaparjuk, és a terméket leoldjuk róla. Ily módon 1,4 g (hozam^55%) cím szerinti vegyületet kapunk. (a]25n = -36,14° (c = 0,5, metanol). Analízis a CN iFL^NcOoF (631,7) képlet alapján: számított : C 58^9%, ff; 6,70%, N: 11,09%, tál ált : C : 57,24%, H : 6,70%, N : 10,46%. c) lépés L-TiroziI-D-treonil-L-(Na-etil)-p-fluor-fenil-alanin-amid, ecetsavas só 15 ml trifluor-ecetsav és 2 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,3 g (2,06 mmól), a b) lépésben leírt módon nyert terméket. Az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot puffer-oldattal (amely 1% piridint és 0,05% ecetsavat tartalmaz), 10 ml térfogatra oldjuk, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, acetát-formában lévő DEAE Sephadex A-25-tel töltött oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezzel a puffer-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a fenti puffer-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk, és a megfelelő frakciókat egyesítjük, majd fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot feloldjuk 10 ml 0,2 n ecetsavban, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, Sephadex G-10-zel töltött oszlopra, amelyet előzőleg 0,2 n ecetsav-oldattal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 0,2 n ecetsav-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 1,6 g (hozam: 87%) cím szerinti vegyületet kapunk. [ft]* p = -8,66° (c = 0,5, 1 n sósav). Analízis a C^oHioNcOqF (591,6) képlet alapján: számított:CT56^4%, ff: 6,47%, N: 11,84%, talált: C: 56,93%, H: 6,48%, N: 11,94%. Amionsav-analízis: Tyr: 1,00, Ihr: 0,99, Gly: 0,99, NEU: 1,09. 3. példa L-N^metil-tirozil-D-alanil-glicil-L-ÍN^etilj-p-fluor-fenil-alanin-amid ecetsav só a) lépés Na-butoxi-karbonil-Na-metil-0-benzíl-L-tirozin, d(+)-a-metil-benzil-amin-só 40 ml, molekulaszűrőn szárított tetrahidro-furánhoz. hozzáadunk 9,28 g (25 mmól) I^-butoxi-karbonil-O-benzil-L-tirozint. Ezt az oldatot fél óra alatt hozzácsepegtetjük 75 mmól kálium-hidrid és 0,125 g ]8-korona-6-éter 100 ml vízmentes tetrahidro-furánnal készült, nitrogén-atmoszférában 0 °C hőmérsékleten kevert elegyéhez. Ezután a reakcióelegyhez 5 perc alatt hozzácsepegtetjük 3,12 ml (0,05 mól) metil-jodid 10 ml vízmentes tetrahidro-furánnal készült oldatát. A reakcióelegyet 2,5 órán át 0 °C hőmérsékleten 185,022 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
