185022. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív tetrapeptid-származékok előállítására
1 2 szilijük és megszárítjuk. Ily módon 6,0 g (hozam: 98%) cím szerinti vegyületet kapunk, op.: 249-251 °C [aj“ ,-, = *15,77° (c = 0,51, metanol). Analízis a Cglit -,N?OClF (21 8,66) képlet alapján: számított : C. 49/14/7, H: 5,53%, N: 12,81%, talált : C. 49,64%, II: 5,83%, N: 13,08%. 0 lépés L-(Na-I:ti!)-p-fluor-fenil-alanin-amid 50 ml vízmentes etanolhoz hozzáadunk 4,4 g (0,02 mól), az e) lépésben leírt módon előállított terméket, majd 6,72 g (0,08 mól) szilárd, vízmentes nátrium-hidrogén-karbonátot, és ezután 1,6 ml (0,02 mól) etil jodidot. Utána a reakcióelegyet 5 órán át forraljuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot kloroformban feloldjuk, és az oldatot felvisszük egy 40x3 cm méretű, szilikagéllel (Grace és Davison, grade 62) töltött oszlopra. Az oszlopot kloroformmal, majd 10%-ig növekvő mennyiségű metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk, és a frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel értékeljük. A megfelelő frakciókból 2,0 g (hozam: 47%) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: 5 = 1,2 (H-N-), 6,8-7,3 (p-fluor-fenil-csoport). g) lépés N01-tercier-butoxi-karbonil-D-alalnil-glicil-L-fN01--eti])-p-f)uor-fenil-alanin-amid 20 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 1,9 g (9 mmól), az f) lépésben leírt módon nyert terméket, az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és hozzáadunk 2,4 g (9 mmól) N^tercier-butoxi-karbonil-D-alanil-glicint, utána 1,22 g (9 mmól) 1-hidroxi-benzotriazolt, és végül 1,86 g diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 4 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 72 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 0 C hőmérsékletre hűtjük, és a csapadékot kiszűrjük. A szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékot feloldjuk etil-acetátban és az oldatot 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, ezután 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk. Vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot acetonban féloldjuk, és felvisszük három preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre. A lemezeket kloroform és metanol 9:1 arányú elegyében futtatjuk, a fő komponenst tartalmazó szilikagélt lekaparjuk a lemezről, és a terméket leoldjuk róla. Ily módon 1,7 g (hozam:43%) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]z rj = 32,17° (c = 0,516, metanol). Analízis a CUiFG. N40<rF (438,5) képlet alapján: számított: Cl 57^2%) If: 7,13%, N: 12,78%, talált: C: 57,42%, H: 7,29%, N: 12,81%. h) lépés L-Tírozil-D-alanil-glicil-L-ÍN^-etílj-p-fluor-fenil-ala-nin-amid, ecetsavas só 20 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegy éhez hozzáadunk 1,5 g (3,6 mmól), a g) lépésben leírt módon nyert terméket. A reakcióelegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztilláljuk. Az olajos maradékot dietil-éterrel hígítjuk, az oldószert leöntjük, és a maradék olajat csökkentett nyomáson megszárítjuk. 1,03 g (3,6 mmól) N^tercier-butoxi-karbonil-L-lirozint feloldunk 5 ml dimetil-formamidban, és az oldahoz -15 °C hőmérsékleten, keverés közben hozzáadunk 0,4 ml (3,6 mmól) N-metil-morfolint és 0,48 ml (3,6 mmól) klórhangyasav-izobutil-észtert. A reakcióelegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keverjük, és eközben elkészítjük az alábbi elegyet: A fenti, első bekezdésben leírt módon elkészített tripeptid-trifluor-ecetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és az elegyhez 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,4 ml N-metil-morfolin, és a reakció teljessé tétele érdekében az oldatot keverjük. Ezt az oldatot hozzáadjuk a vegyes anhidrid fent leírt módon elkészített oldatához, és a reakcióelegyet 4 órán át keverjük. Utána az elegyet jeges 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, és a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos részt vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, majd megint vízzel mossuk, magnéziumszulfáton megszárítjuk, és csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot (súlya: 1,7 g) feloldjuk 15 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyében, és az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük. Ezután az oldatot fagyasztva szárítjuk, a szilárd maradékot puffer-oldatban (amely 1% piridint és 0,05% ecetsavat tartalmaz) 10 ml térfogatra oldjuk. Az oldatot felvisszük egy 2,5x9,0 cm méretű, DEAE Sephadex A 25-tel töltött oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezzel a puffer-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a fenti puffer-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nmnél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A fehér színű, szilárd maradékot feloldjuk 10 ml 0,2 n ecetsavbar., és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cin méretű Saphadex G-10-zel töltött oszlopra. Az oszlopot 0,2 n ecetsavval eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 1,18 g (hozam: 58%) cím szerinti vegyületet kapunk. [apD = *14,62° (c = 0,5,1 n sósav). Analízis a CU^FUf-NrO-iF (561,6) képlet alapján: számított : C: 5 77%,TI : 6,46%, N : 12,47%, talált : C: 57,53%, H: 6,65%, N: 12,19%. Aminosav-analízis: Tyr: 9,88, Alá: 0,99, Gly: 1,00, NEU: 1,06. 2. példa L-Tirozil-D-treonil-glicil-L-(Na-etil)-p-fluor-fenil-alanin-amid a) lépés N°-tercier-butoxi-karbonil-glicil-L-(Na-etil)-p-fluor-fenil-alanin-amid 20 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 2,4 g (11,4 mmól) L-fN^-etiO-p-fluor-fenil-alanin-amidot, majd az elegyhez 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk 1,99 g (11,4 mmól) N^tercier-butoxi-karbonil-glicint, majd 1,54 g (11,4 mmól) 1-hidroxi-benzotriazolt, és végül 2,35 g (11,4 mmól) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten, maid 72 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 0 °C hőmérsékletre hűtjük, a csapadékot kiszűrjük és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetátban, majd az oldatot 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, ezután 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk. Vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk kloroformban, és felvisszük egy 40x3 cm méretű, szi-185.022 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
