185021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklusos hexapeptidek előállítására
1 2 dikálium-hidrogén-foszfát 2 g csapvíz 1000 ml (az eredeti pH 6,1). X = N-Z-Case, 3. példa Az A-42355 antibiotikum komplex elkülönítése 4127 1, a 2. példában megadottak szerint a V. jelű termelő táptalajjal előállított teljes fermentlevet 4280 1 metanollal egy órán át alaposan keverjük,,majd szűr-Íük Hyflo Super-cel (diatómaföld, Johns-Manville ’roducts Corp.), szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A szűrlet pH-ját 5 n hidrogén-kloriddal 4,0-ra állítjuk be. A savas szűrletet két alkalommal azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk. Egyesítjük a kloroformos extraktumokat és csökkentett nyomáson desztillálva 201-re töményítjük. A sűrítményhez 200 1 dietilétert adunk az A-42355 komplex kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, amikor szürkésfehér színű por-alakú anyagként 2775 g A-42355 komplexet kapunk. 4. példa Az A-30912 A komponens izolálása A 3. példában megadottak szerint előállított A-42355 antibiotikum komplex 1 g-ját metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének 7 ml-ében oldjuk. Az oldatot szűrjük és 3,7 cm belső átmérőjű 35 cm hosszúságú LP-1/Ci8 szilikagéllel (reverz fázisú, 10-20 /u méretű szemcse) töltött üvegoszlop (Michel-Míller High Performance Low Pressure kromatográfiás oszlop, Ace Glass Invorporated, Vineland, NJ 08360) tetejére öntjük a szűrletet. A kromatografáló oszlopot a 10. példában megadottak szerint állítjuk elő, az oldatot szeleprendszer segítségével juttatjuk az oszlop tetejére. Az oszlopot metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének felhasználásával szuszpenzió-töltő módszerrel készítjük el, ahogy azt a 11. példában ismertetjük. Az oldószert F.M.I. szelepmentes pumpával (maximális sebesség 19,5 ml/perc) mozgatjuk, az oszlopon át, az áramlás sebessége körülbelül 9 ml/perc, az alkalmazott nyomás 0,45 atm. Minden percben elkülönítünk egy frakciót. Az antibiotikum eluálódását 280 nm-en működő UV-monitorral követjük (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superioir Ave., Lincoln, Nebraska, 68504), optikai egységként ISCO Type 6-ot használunk. A 112-140. frakciót egyesítjük és 20 ml vízhez adjuk. Az oldatot kétszer azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk, a kloroformos extraktumokat egyesítjük és csökkentett nyomáson olajos desztillációs maradékig desztilláljuk. Ezt az olajat tercier-butanolban oldjuk, az oldatot fagyasztva szárítjuk, amiután 524 mg A-42355 A komponenst (A-30912 A kom: ponens, A-22082) kapunk. 5. példa Az A-30912 B komponens izolálása A 3. példában megadottak szerint A-42355 komplexet izolálunk, azzal a különbséggel, hogy a 285 1 térfogatú tömény kloroformos extraktumot szilikagélből (150 1 Grace szilikagél, grade 62) készült oszlopon kromatografáljuk 2 liter/perces eluálási sebességgel. Az oszlopot 200 l kloroformmal mossuk, az eiuálást 500 1 acetonitrillel kezdjük, majd acetonitril é; víz 98:2 arányú elegyével folytatjuk 1 liter/perc sebességgel. Körülbelül 200 1 térfogatú frakciókat szedünk, és egyenként analizáljuk őket a biológiai aktivitás szempontjából. A biológiai érték-mérést agarlemezeken papírkorong módszerrel végezzük Candida albicans mikroorganizmus segítségével. A 77-103. frakciókat (1365 1) egyesítjük és csökkentett nyomáson töményítjük. A 4,5 1 térfogatú sűrítmény csapadékot tartalmaz, ezt szűréssel elkülönítjük, amiután 119 g B komponensben gazdag A-42355 komplexet kapunk. A szűrletet szárazra desztilláljuk, a desztillációs maradékot megfelelő mennyiségű metanolban oldjuk. A metanolos oldatot 10-szeres mennyiségű dietil-éterhez adjuk a B komponenst tartalmazó antibiotikum komplex kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, amiután további 24 g B komponensben gazdag szürke színű, por-alakú termékként A-42355 komplexet kapunk. Az így kapott, B komponensben gazdag A-42355 komplex 1,0 g-ját metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének 8 ml-ében oldjuk. Az oldatot szűrjük és szeleprendszer segítségével 3,7 cm átmérőjű, és 33 cm magas Michel-Miller oszlopba töltött szilikagél tetejére juttatjuk. Az oszlopot a 10. példában megadottak szerint metanol, víz és acetonitril 7:29:1 arányú elegyével készült 10—20 jx átmérőjű szemcsékből álló reverz fázisú LP-1/Ci8 szilikagélből készítjük. A szuszpenzió feltöltését a 11, példában megadottak szerint végezzük. Az oldószert 0,45 atm nyomás mellett percenként 10 inl-es sebességgel áramoltatjuk F.M.I. pumpa segítségével. Minden percben egy frakciót szedünk. Az antibiotikum eluálódását a 15. példában megadottak szerint 280 nm-en regisztráló UV-monitorral követjük. A 102-110. frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson olajos-desztillációs maradékig desztilláljuk. Kevés tercier-butanolban oldjuk az olajat, majd az oldatot fagyasztva szárítjuk, amiután 22 mg A-30912 B komponenst kapunk. 6. példa Az A-30912 D komponens izolálása 2 db 3800 1 -es és 4007 1-es fermentációból származó. tömény kloroformos extraktumot állítunk elő a 3. példában megadottak szerint, a sűrítményeket egyesítjük és szilikagélből készült kromatografáló oszlopon kromatografáljuk (Grace, grade 62). Kloroformmal mossuk azoszlopot,majd acetonitrillel és acetonotrii és víz 98:2 arányú elegyével eluáljuk. Körülbelül 200 1 térfogatú frakciókat gyűjtünk és agarlemezen papírkorong módszerrel Candida albicans mikroorganizmussal vizsgáljuk a biológiai aktivitásukat. Az aktivitással rendelkező frakciókat egyesítjük, majd 850 1 térfogatú oldatot csökkentett nyomáson desztilláljuk. A 0,7 1 térfogatú sűrítményt 10-szeres térfogatú dietil-éterhez adjuk, a D komponensben gazdag A-42355 komplex kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, szárítjuk, amiután 32 g D komponensben gazdag, szürke por-alakú anyagként A- 42355 komplexet kapunk. Az így előállított D komponensben gazdag A- 42355 komplex 1,0 g-ját metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének 5 ml-ében oldjuk. Az oldatot szűrjük és szeleprendszer segítségével 3,7 cm belső átmérőjű, és 30 cm hosszú Michel-Miller oszlopban lévő szilikagél tetejére juttatjuk, szeleprendszer segítségével. Az oszlopot a 10. példában megadott módon előállított 10-20 n szemcseméretű reverz fázisú LP-1/C1# szilikagéllel készítjük. A töltést all. példában megadott módon, szuszpenzió-töltő módszerrel végezzük metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyének segítségével. Az oldószert 8 ml/perces sebes185.021 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
