185021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklusos hexapeptidek előállítására
1 2 185.021 Mennyiség 60.0 g 2,5 g 1,0 g 5.0 nil 25.0 g 1 1-re feltöltve lajok egyikét használjuk: A táptalaj Összetevő csecsemő zabliszt élesztő dikáUurn-hidrogén-foszfát Czapek ásványi sóoldatax agar Ionmentes víz A táptalaj pH-ját autoklávozás előtt 5,9, ezt nátrium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk be. A pH autoklávozás után 6,7. x = Czapek ásványi sóoldatának összetevői a következők: összetevő mennyiség FeS04.7Hj0 (2 ml tömény sósavban oldva) 2 g kálium-klorid 100 g magnézium-szulfát. 7 víz 100 g ionmentes víz 1 1-re feltöltve Mennyiség 5.0 g 0,5 g 3.0 g 0,5 g 12,5 g 5.0 g 5.0 g 2,5 g 0,25 g '1,0g 2,0 ml 20 0 g 11-re feltöltve B táptalaj összetevő burgonyadextrín élesztőkivonat enzimatikusan hidrolizált kazeinx kuskivonat dextróz kukoricakeményítő húspepton répamelasz magnézium-szulfát.7 víz kalcium-karbonát Czapek ásványi sóoldata agar ionmentes víz x = N-Z-amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J. A ferde agart beoltjuk az Actionplanes utahensis NRRL 12052 törzzsel, majd 30 °C hőmérsékleten 8-10 napon át ínkubáljuk a tenyészetet. A ferde agar tenyészet felével 50 ml, alábbi összetételű vegetatív táptalajt oltunk: összetevő ' Mennyiség előfőzött zabliszt 20,0 g szacharóz 20,0 g élesztő 2,5 g desztillációs maradék* 5,0 g dikálium-hidrogén-foszfát 1,0 g Czapek ásványi sóoldata 5,0 ml Ionmentes víz 11-re feltöltve. A táptalaj pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,4-re állítjuk be, a táptalaj pH-ja autoklávozás után 6,8. * = National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, N,Y. A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml térfogatú, szélesszájú Erlenmeyer-lombikban inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 72 órán át olyan körkörösen kitérő rázógépen, amely percenként 250-et forog, és amely körülbelül 5 cm-es átmérőjű kör mentén mozog. Ezt a vegetatív tenyészetet közvetlenül felhasználhatjuk egy második vegetatív táptalaj oltására. Egy másik kivitelezési változat szerint, és előnyösen úgy járunk el, hogy ezt későbbi felhasználásra folyékony nitrogén gőziázisában tároljuk. A tenyészetet ilyenfajta tárolásra kis ampullákba osztjuk szét, az alábbiak szerint: mindegyik ampullába 2 ml kinőtt vegeta-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 tív tenyészetét és 2 ml glicerin-laktóz-oldatot teszünk (lásd Hailey és Higgens, Preservation and Storage of Microorganism in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10, 364-367., 1973). Az elkészített szuszpenziókat a folyékony nitrogén feletti gőzfázisban tároljuk. 1 ml ily módon tárolt szuszpenzióval 50 ml első fázisú vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele azonos az előzőekben megadott táptalaj-összetétellel. A beoltott vegetatív táptalajt a fentiek szerint tenyésztjük. Nagyobb térfogató inokulum előállítására 10 ml kinőtt első fokozatú vegetatív táptalajjal 400 ml második vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele azonos az első vegetatív táptalaj összetételével. Ezt a második inokulumot két liter térfogatú, szélesszájú Erlenmeyer-lombikban tenyésztjük 30 °C hőmérsékleten 48 órán át olyan körkörös kitérésű rázógépen, amely percenként 250-et tér ki, kb. 5 cm átmérőjű kör mentén. A fentiek szerint előállított, kinőtt, második vegetatív tenyészet 800 ml-ével 1001 steril, termelő táptalajt oltunk. A termelő táptalajt az alábbiak közül választjuk ki: I. táptalaj összetevő Mennyiség (g/1) mogyoró liszt 10,0g oldható húspepton 5,0 szacharóz 20,0 kálium-dihidrogén-foszfát 0,5 dikálium-hidrogén-foszfát 1,2 magnézium-szulfát. 7 víz 0,25 csapvíz 1 1-re feltöltve A táptalaj pH-ja sterilezés után 6, 9, a sterilezést 121 °C hőmérsékleten 45 percen át végezzük. II. táptalaj összetevő Mennyiség (g/1) szacharóz 30,000 pepton 5,000 dikálium-hidrogén-foszfát 1,000 kálium-klorid 0,500 magnézium-szulfát. 7 víz 0,002 ionmentes víz 11-re feltöltve A táptalaj pH-ját hidrogén-kloriddal 7,0-ra állítjuk be, a táptalaj pH-ja sterilezés után 7,0. III. táptalaj összetevő glükóz ammónium-klorid nátrium-szulfát cink-klorid magnézium-klorid. 6 víz vas-triklorid. 6 víz mangán-diklorid. 4 víz réz-klorid . 2 víz kalcium-karbonát kálium-dihidrogén-foszfát csapvíz Mennyiség (g/1) 20,000 3.000 2.000 0,019 0,304 0,062 0,035 0,005 6,000 0,670 1 1-re feltöltve x * Külön sterilezzük, és sterilen adagoljuk. A táptalaj sterilezés utáni pH-ja 6,6. A beoltott termelő táptalajjal 165 liter össztérfogatú fermentorban fermentálunk 30 °C hőmérsékleten 42 órán át. A fermentációs táptalajt ismert keverővei keveijük, a keverő percenként 200-at fordul. A táptalajon annyi steril levegőt buborékoltatunk át, hogy az oldott oxigén koncentrációja az atmoszféri-9
