185021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklusos hexapeptidek előállítására
1 2 185.021 crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, míg a dezacilezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez. B. Az A-30912 H alapvegyület izolálása Az előző, A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrjük. A miçéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az effluenst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5-7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosófolyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 7 3 arányú elegyével eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatra töményítjük, és savkloridot, például mirisztoil-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-mérjük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a frakció A-30912 H alapvegyületet tartalmaz. Az A-30912 H alapvegyületet tartalmazó eluátumokat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet. C. Az A-30912 H alapvegyület tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiával A B. pontban kapott nyers A-30912 H alapvegyületet a 19. példa C. pontjában megadottak szerint tisztítjuk. A 280 nm hullámhosszon mért abszorpció alapján az A-30912 H alapvegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tiszta A-30912 H alapvegyületet kapunk. 24. példa A 23. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként tetrahidro-A-30912 H-t használunk, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 H alapvegyületet. 25. példa A 23. példában megadottak szerint előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 H alapvegyületet, azzal a különbséggel, hogy az A-30912 H komponenst az A-30912 A komponensből állítjuk elő, az alábbi eljárás szerint: I ml dimetil-formamidban 19,6 mg A-30912 A antibiotikum-komponenst oldunk. Az oldathoz 0,06 ml 3%-os, metanolos hidrogén-klorid oldatot adunk. A kapott oldatot egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertük, majd szárazra pároljuk csökkentett nyomású térben. A kapott desztillációs maradékot a 7. példában megadottak szerint nagyfelbontású folyadékkromatográfiával tisztítjuk, a tisztítást reverz fázisú szilikagéllel (LP-1/Cia, a 10. példában megadottak szerint állítjuk elő), és metanol, víz és acetonitril 7:2:1 arányú elegyével végezzük. Ily módon 1,4 mg A-30912 H komponenst kapunk (a vegvület az a II általános képletű vegyület, ahol R1 és R* hidroxilcsoport, RJ hidrogénatom, R3 metoxicsoport, és R linoleoilcsoport). 26. példa A. Az S 31794/F-l antibiotikum dezacilezése Az 1. példában megadottak szerint eljráva, I. ter5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 melő-táptalajt használva fermentáljuk az A. utahensis mikroorganizmust. 48 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd kevés metanolban oldott S 31794/F-l komponenst adunk a tenyészethez. Az S-31794/F-1 komponens dezacilezését papírkorong módszerrel, Candida albicans vagy Neurospora crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, míg a dezacüezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez. B. Az S 31794/F-l alapvegyület izolálása Az előző A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrjük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az efflienst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5-7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosófolyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 7:3 arányú elegy ével eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatra töményítjük és savkloridot, például mirisztoil-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-méijük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a frakció S 31794/F-l alapvegyületet tartalmaz. Az S 31794/F- 1 alapvegyületet tartalmazó frakciókat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet. C. Az S 31794/F-l alapvegyület tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiával A B. pontban kapott nyers S 31794/F-l alapvegyületet a 19. példa C. pontjában megadottak szerint tisztítjuk. A 280 nm hullámhosszon mért abszorpció alapján egyesítjük az S 31794/F-l alapvegyületeket tartalmazó frakciókat, csökkentett nyomáson desztilláljuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tiszta S 31794/F-l alapvegyületet kapunk. A 16—26. példákban előállított alapvegyületek NMR-spektrumát az alábbiakban adjuk meg. Az egyes aminosav-komponenseknél kapott csúcsokat minden alapvegyületnél külön-külön adjuk meg. A mérést DMSO-dj oldószerben, 360 MHz-nél végeztük, ppmben kifejezve. A-30912 A alapvegyület metil-hidroxi-prolin (1) részképlet dihidroxi-ornitin (2) részképlet treonin/1 (3) részképlet treonin/2 (4) részképlet dihidroxi-homo-tirozin (5) részképlet a = 4,17,0=4,01,7=2,33, CH3 =0,95, 5 = 3,82 és 3,17. a = 3,22,0= 1,69 és 1,42, 7 =3,79,5= 5,20, NH = 7.89. NH = 7,24, a = 4,64, 0 = 3,88, CH3 = 1,06. NH = 8,03, a = 4,76, 0 = 4,39, CH3 = 1,06. NH = 7,39, a = 3,94,0= 3.90, 7 = 4,18, orto = 6,99, meta = 6,66. 16
