184972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán gamma-interferon előállítására
3 184972 4 Találmányunk humán gamma-interferon új és javított előállítására vonatkozik. Ismeretes, hogy a humán fehérvérsejtek mitogén ágensek hatására gamma-interferont (immun-interferon) termelnek. A gamma-interferon mind fizikokémiai, mind 5 biológiai tulajdonságait tekintve különbözik a virus hatására leukocitákban képezett, illetve vírus- vagy szintetikus polinukleotidok hatására fibroblast eredetű sejtekben termelt leukocita (alfa) vagy fibroblast (beta) interferontól. A gamma-interferon sejtosztódás gátló, továb- 10 bá az immún-rendszer sejtjeinek működését befolyásoló hatása kifejezetten kedvezőbb az alfa- és beta-interferonok aktivitásánál, ezért egyre elterjedtebb felhasználása várható a daganatos betegségek terápiájában [Nature 294, 7, 1981 Cellular Immunology 49, 390, 1980], 15 A gamma-interferon előállítása oly módon történik, hogy a vér leukocita frakcióját (buffy coat) elválasztják, a vörös vérsejteket gradiens centrifuálással vagy előnyösen ammónium-kloridos hemolízissel eltávolítják, a tisz- 20 titott leukocitákat inkubálják, majd megfelelő aspecifikus mitogénekkel kezelik, végül a termelt gamma-interferont a felülúszó (szupernatant) folyadékból elkülönítik. Az irodalom szerint mitogén ágensként Concanavalin A [Infect. Immun. 26, 36, 1979], Phytohaemaggluti- 25 nin [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 1601, 1981], vagy Enterotoxin [Int. Res. Commun. Sys. Med. Sei., 7, 595, 1979] alkalmazható. Az irodalom szerint több próbálkozás történt a autogének által stimulált gamma-interferon termelés fokozá- 30 sára. Az egyik módszer alapján a gamma-interferon termelést a fehérvérsejtek 12—0-tetradekanoii-phorbol-13- -acetáttal történő előkezelésével fokozzák [Vilcek és tsai: Biochemical Characterization of Lymphokines (Academia, New York) 323. oldal, 1980]. A módszer 35 hátránya, hogy a 12—0-tetradekanoil-phorbol-13-acetát kancerogén anyag, ezért a felhasználásával készített gamma-interferon a humán gyógyászatban aligha alkalmazható. Megkísérelték a gamma-interferon termelésnek a fehérvérsejtek nátrium-butiláttal vagy dexa- 40 methasonnal történő fokozását, e próbálkozások azonban nem jártak eredménnyel [Nature, 292, 842. 1981], Ismeretes, hogy az alfa-interferon termelése kb. 100 NE/ml alfa-interferonnal történő előkezeléssel fokozható. (ADVEXP MED Bioi. 110: Humán Interferon 45 Production and Clinical Use (W. R. Stinebring és P. J. Chappie kiadók) Plenum, New York (1978) (C. A. 90 101 861); SYMP SER IMMUNBIOL STAND 1970, 14, 6—8 (C. A. 74 62 757); VOP VIRUSOL, 1970, 15 (4) 432—5 (C. A. 73 118 257); J. VIROL. 1971 7 (6), 50 792—801 (C. A. 75 6130), IGAKU NO AYUMI 1980, 113 (5), 303.5 (C. A. 93 65 374). Az alfa- és gamma-interferon azonban egymástól mind a fehérje-szerkezetben, mind a biológiai hatásban jelentős mértékben eltér, ezért a fenti irodalmi helyeken ismertetett eljárások 55 gamma-interferon előállítására nem alkalmazhatók. A 80—154 919 sz. közrebocsátott japán szabadalmi bejelentés (KOKAI) szerinti eljárásnál az interferon termelés fokozására gamma-interferont alkalmaznak 100 NE/ml mennyiségben. A sejteket a gamma-interferon 60 termelés második napján Sendai-vírussal megfertőzik, és ily módon a gamma- és alfa-interferon együtt termelődik, amelyek egyedi titerét az interferonok egymás antivirális hatását erősen potencírozó aktivitása miatt nehéz pontosan meghatározni. A gamma-interferon termelése 65 a fenti módszerrel számottevő mértékben nem fokozható. Találmányunk célkitűzése a fehérvérsejtekből mitogén ágensek hatására történő gamma-interferon termelés fokozása, az egységszám növelése. Találmányunk tárgya eljárás humán gamma-interferon előállítására a vér fehérvérsejt-frakciójának (buffy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukocyták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása, valamely mitogén ágenssel történő kezelése, majd az interferon-tartalmú folyadéknak a sejtektől történő elválasztása útján, oly módon, hogy a fehérvértesteket a mitogén ágenssel történő kezelés előtt 200—20 000 NE/ml mennyiségű alfa- vagy beta-interferonnal előkezeljük. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy amennyiben a fehérvérsejteket a mitogén ágenssel való kezelés előtt alfa- vagy beta-interferonnal történő előkezelésnek vetjük alá, a gamma-interferon termelés lényegesen — kb. 500—1000%-kal — fokozódik. Az alfa- vagy beta-interferont 200—20 000, előnyösen 500—5000 NE/ml mennyiségben alkalmazhatjuk. Eljárásunk egyik előnyös foganatosítási módja szerint a kezelést 1000—2000, különösen előnyösen 1500 NE/ml mennyiségű alfa-interferonnal végezzük el. Eljárásunk másik előnyös foganatosítási módja szerint az előkezeléshez 2000—3000, különösen előnyösen 2500 NE/ml mennyiségű beta-interferont alkalmazunk. Az előkezelést előnyösen a mitogénnel történő kezelést megelőzően 1—12, célszerűen 2—8, különösen előnyösen 4 órával hajtjuk végre. Az alfa- vagy beta-interferonnal történő kezelés időtartama 1—12, előnyösen kb. 4 óra. Az előkezelést 35—39 °C, előnyösen 37 °C-os hőmérsékleten végezzük el. Az alfa- vagy beta-interferonnal történő előkezelés után, a mitogén ágens hozzáadása előtt, az interferont előnyösen eltávolítjuk, éspedig a sejtek kimosása útján. A mosáshoz előnyösen Hanks-féle oldatot alkalmazhatunk. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy az előkezeléshez használt interferont a sejtek tápfolyadékában hagyjuk. Ez esetben a termelt gamma-interferont az előkezelésnél alkalmazott alfa- vagy beta-interferontól el kell választani-A szétválasztás önmagában ismert módon történhet pl. CPG üvegkromatográfiás módszerrel. Az eljárásnál tápfolyadékként különböző aminosavakat és vitaminokat tartalmazó szövetkultúra-tápoldatok alkalmazhatók (pl. Eagle-féle MEM, RPMI 1640, Dulbecco-féle MÉM, Glasgow-féle módosított MÉM) A fenti tápoldatok készítése a Flow Laboratórium évente kiadott katalógusa vagy a Gibco cég által kiadott katalógus alapján történik. Előnyösen alkalmazható továbbá az alábbi összetételű, olcsó, autoklávozható tápoldat : Komponens Mennyiség kalcium-klorid kálium-klorid magnézium-szulfát vagy ekvivalens magnézium-klorid nátrium-klorid nátrium-hidrogén-karbonát nátrium-dihidrogén-foszfát 175—350 mg/1 300—500 mg/1 175—500 mg/1 5000—7000 mg/1 200—3500 mg/1 30—150 mg/1 3
