184972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán gamma-interferon előállítására
5 184972 6 Komponens Mennyiség glükóz 500—5500 mg/1 ferri-nitrát 0—0,2 mg/1 szérum © o A gamma-interferon termelését különböző állati vagy emberi savó, illetve gammaglobulin mentesített savó (0,5—10%) jelenlétében végezzük el. A találmányunk tárgyát képező eljárásnál kiindulási anyagként alvadásában gátolt, legfeljebb 72 órán át 0—8 °C-on tárolt emberi vérből származó fehérvérsejteket (buffy coat) alkalmazunk. Alvadásgátlásra ACD-oIdatot (citromsavat és dextrózt tartalmazó oldat) vagy különböző bázisokkal (pl. adeninnel vagy guaninnal) kiegészített ACD-oldatot alkalmazhatunk. Az összegyűjtött fehérvértesteket gradiens-centrifugálással (pl. a Pharmacia svéd cég által forgalomba hozott Ficoll vagy Percoll segítségével) vagy előnyösen ammónium-kloriddal történő hemolízissel távolíthatjuk el. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a koncentrált fehérvérsejt-szuzsperiziót 0,5—1%-os — előnyösen 0,83%-os — 0—10 °C hőmérsékletű ammónium-klorid-oldattal elegyítjük 1 : 3—20 előnyösen 1 : 5 térfogatarányban. A szuszpenziót 5—20 percen át — előnyösen kb. 10 percig — 0—8 °C-on keveréssel vagy anélkül inkubáljuk. A szétesett vörösvértestektől (pl. centrifugálással) elválasztjuk a leukocytákat. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy az ammónium-kloridos kezelést megismételjük úgy, hogy 1 térfogatxész sejtszuszpenzióra 10 térfogatrész ammónium-klorid-oldatot alkalmazunk. A tisztított fehérvérsejteket ezután megfelelő szövetkultúra tápfolyadékban (Eagle-féle MEM, RPMI 1640, Dulbecco-féle MÉM, Glasgow-féle módosított MÉM) vagy az előzőekben ismertetett összetételű, olcsó, aminosavakat és vitaminokat nem tartalmazó tápoldatban szuszpendáljuk és a sejtszámot 106—108 sejt/ml értékre beállítjuk. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a sejtek újraszuszpendálásához és a sejtszám beállításához az előzőekben megadott összetételű, aminosavakat és vitaminokat nem tartalmazó tápoldatot alkalmazzuk. A felhasznált tápfolyadékot, illetve tápoldatot valamely állati vagy emberi szérummal vagy gamma-globulinmentesített szérummal, előnyösen emberi gamma-globulin-mentes szérummal egészítjük ki (0,5—-10%). A tápfolyadékhoz vagy tápoldathoz előnyösen valamely antibiotikumot is adunk, célszerűen neoimicint éspedig kb. 10—50 [xg/ml, előnyösen 25 [Xg/ml koncentrációban. Ezután a sejteket alfa- vagy beta-interferonnal történő kezelésnek vetjük alá. E célra inducer-mentes (vírus vagy szintetikus polinukleotid) nyers vagy tisztított alfavagy beta-interferont alkalmazunk 200—20 000 NE/ml mennyiségben. Az előkezelés hőmérséklete 35—39 °C, előnyösen 37 °C, időtartama 1—12 óra, előnyösen 4 óra. A sejtektől ezután az előkezelésre használt interferont előnyösen mosással elválasztjuk. A mosást célszerűen Hanks-oldattal végezzük el. Az interferon kimosása után a sejtkoncentrációt az eredeti mértékre állítjuk be, tápfolyadékban, vagy tápoldatban, mely emberi vagy állati szérumot vagy gammaglobulin-mentes szérumot, előnyösen humán gammaglobulin-mentes szérumot tartalmaz. Az interferon kimosása nem elengedhetetlenül szükséges, minthogy az alfa- vagy beta-interferon jelenléte a gamma-interferon termelését nem zavarja. Ez esetben a termelt gamma-interferont a jelenlevő alfa- vagy betainterferontól utólag ismert módon választjuk el. A sejteket ezután valamely interferon inducerrel hozzuk érintkezésbe. E célra — mint már említettük — előnyösen Concanavalin A, Phytohaemagglutinin, Staphyloccocus enterotoxin stb. alkalmazható. Eljárásunk előnyös foganatosítási módja szerint inducerként Concanavalin A-t alkalmazunk, előnyösen 2,5—30 ug/ml, különösen előnyösen 15 (xg/ml koncentrációban. Az indukció időtartama 5—48 óra, előnyösen 10—12 óra, az alkalmazott hőmérséklet 35—39 °C, előnyösen 37 °C. Az inducert bizonyos idő (kb. 1 óra) elteltével kívánt esetben mosással eltávolíthatjuk; ez a művelet azonban elhagyható, minthogy az inducer jelenléte a gamma-interferon termelést nem zavarja. Az inducert általában nem távolítjuk el. Ezután a sejteket a folyékony fázistól centrifugálással elválasztjuk. A felülúszó (szuszpematans) réteg tartalmazza a nyers gamma-interferont, melyet alacsony hőmérsékleten kb. —20 °C-on tárolhatunk, vagy ismert módszerekkel tisztíthatunk. A találmányunk tárgyát képező eljárás előnye, hogy az alfa- vagy beta-interferonnal történő előkezelés hatására a termelt gamma-interferon mennyisége 5—10- szeresére fokozódik. Az eljárásunkkal készített gammainterferon mind fizikokémiai tulajdonságait (pH 2 érzékenység, 56 °C-on és 37 °C-on mért stabilitás) mind biológiai aktivitását (antivirális és anticelluláris hatás) tekintve teljesen megegyezik az ismert módon előállított gamma-interferonnal. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk : 1. példa Véradóktól ACD oldattal (2% nátrium-citrát, 3% dextróz és 0,51% citromsav, desztillált vízben) levett vérmintákat 3 órán át +4 °C-on tárolunk, majd 2000— 3000 g-val 20—30 percig centrifugálunk. A fehérvérsejtekben gazdag „buffy coat” frakciót egy éjszakán át +4 °C-on tároljuk. Egy térfogatrész ily módon kapott fehérvérsejt-koncentrátumot 5 térfogatrész 0,83%-os +4 °C hőmérsékletű vizes ammónium-kloriddal elegyítünk. A szuszpenziót a vörösvértestek feloldódásáig (5—10 perc) +4 °C-on tartjuk, majd a leukocitákat 1500 g-vel +4 °C-on 10 percen át végzett centrifugálással kinyerjük. A fehérvérsejteket az alábbi összetételű tápoldatban szuszpendáljuk : Komponens Koncentráció mg/1 kalcium-klorid 265 ferri-nitrát 0,1 kálium-klorid 400 magnézium-szulfát-heptahidrát 200 nátrium-klorid 6400 nátrium-hidrogén-karbonát 2750 nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 140 glükóz 4500 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
