184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű Fab-Sj -(X)n-Sj -FA (I) új daganatellenes hatású immunoglobulin-származékék előállítására. A képletben Fab egy daganatellenes immunoglobulin Fab fragmentuma, FA egy diftéria toxin A fragmentuma, X jelentése (A), S| és S2 egyaránt kénatomot jelent, ahol Sj egy immunoglobulin szulfid-kötéséből származó, Sj pedig egy diftéria toxin diszulfid kötéséből származó kénatom, n értéke 0 vagy 1. Közelebbről a találmány olyan új protein előállítására vonatkozik, amely, miután molekulájának egyik része lényegében megfelel egy daganatellenes hatású immunoglobulin Fab fragmentumának (Fab = Fragment antigen binding), másik része pedig lényegében a diftéria toxin A fragmentumával egyezik meg, különösen jó hatást mutat rosszindulatú daganatokkal szemben. Bár számos szer ismeretes rosszindulatú daganatok, így rák kezelésére, ezek közös hátránya, hogy általában nem alkalmazhatók olyan dózisokban, amelyek megsemmisítenék a daganatsejteket, mert a daganatsejteken kívül az egészséges sejtekre is számottevő toxikus hatást fejtenek ki. Több esetben ezt a súlyos problémát úgy kísérelték megoldani, hogy a tumor-ellenes szert vagy citotoxikus protein toxint egy specifikus vivöanyaggal kombinálták, annak érdekében, hogy a hatóanyag specifikusan a daganat-sejteken adszorbeálódjék. A rákos beteg vérében vagy a daganat sejtek felületén nagyon kis mennyiségben jelen van egy daganatellenes ellenanyag (daganatellenes immunoglobulin). Daganatellenes ellenanyaghoz juthatunk úgy is, hogy egy állatot daganatsejtekkel immunizálunk, és a kapott antiszérumot az egészséges emberi sejteken abszorbeáljuk. A daganatellenes ellenanyagok nem mindig alkalmasak citotoxikus hatás kifejtésére daganatsejtekkel szemben, közös vonásuk azonban, hogy rendkívül nagy szelektivitást mutatva kötődnek a daganatsejtekhez. így a daganatellenes ellenanyagokat használták a tumor-ellenes szerek vagy protein toxinok vivőanyagaként, annak érdekében, hogy biztosítsák a szelektív kötődést a daganatsejtekhez. így például a 4 093 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint egy ellenanyag és egy tumor-ellenes szer kombinációjából hoztak létre tumor-ellenes hatású gyógyszert. A készítményben a tumor-ellenes szer, például daunomicin kovalensen kötődik a tumor-ellenes immunoglobulin Fab dimeréhez. Ez a megoldás annyiban előnyös, hogy a tumor■ellenes szert szelektíven a kívánt helyre, a daganatsejtekhez juttatja, mivel azonban az ellenanyaghoz kötődő tumor-ellenes szer, így például a daunomicin nemcsak a daganatsejtekre, hanem a normál sejtekre is citotoxikus, a megoldás nem biztosítja, hogy csak a daganatsejtek károsodjanak, és az így kapott készítmények citotoxicitása sem mindig kielégítő. Például F.L. Moolten és munkatársai (Journal of the National Cancer Institute, 55. 473-477 /1975Q leírták, hogy nyulak anti-SV40-transzformált-hörcsög sarcoma vagy limfoma ellenanyagát diftéria toxinhoz kapcsolták, kapcsolószerként glutársav-aldehidet használva, és a kapott készítményt hörcsögök szervezetébe juttatva meg tudták védeni azokat az SV4-transzformált tumorral szemben. P.E. Thorpe és munkatársai: (Natura, 271, 752- 754 /1978/) megfigyelték, hogy a diftéria toxin és antilimfocita ellenanyag klorambucil segítségével történő összekapcsolásából létrejövő konjugátum erősen csökkenti az emberi lomfoblasztoid sejtek (CLA4) protein szintézisét. E kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a diftéria toxin ellenanyaggal létrehozott konjugátum szelektive toxicitást mutat a daganat-sejtekkel szemben. E konjugátumok daganat-ellenes gyógyszerként történő felhasználásának azonban van néhány hátránya. A henogén ellenanyag (immunoglobulin) az emberi szervezetben erős antigén hatást mutat, és így csökkenti a tumor-ellenes aktivitást, valamint anafilaxiás sokkot okoz. Másik hátránya, hogy nem szűnik meg a diftéria toxin nem specifikus toxicitása. Közelebbről, e módszerek célja, hogy a diftéria toxint tumor-ellenes ellenanyag segítségével a daganatsejtek felületéhez kössék, miután azonban a konjugátum a diftéria toxin teljes molekuláját tartalmazza, a normál sejtek felületén található diftéria toxin receptor helyekkel is képes kötődni, és így az egészséges sejtekkel szemben is vitotoxikus. A megoldás harmadik hátránya az antitest és a diftéria toxin térhálósításával kapcsolatos. Sok térhálósító szer, Így például a glutársav-aldehid, toluol-diizocianát, klorambucil, nemcsak az ellenanyagot és toxint térhálósítja egymással, hanem ellenanyag és ellenanyag és toxin és toxin között is létrehoz térhálós kötéseket, sőt, az ellenanyag és a toxin molekulájában intramolekuláris kötéseket is kialakít, így olyan nem kívánatos melléktermékek keletkezéséhez vezet, amelyek csökkentik a tumor-ellenes hatást. A találmány célkitűzése a technika állása szerint ismert megoldások hátrányainak kiküszöbölése, és olyan tumor-ellenes szer létrehozása, amely jelentős szelektív citoxicitást mutat daganat-sejtekkel szemben. A találmány tárgya eljárás olyan tumor-ellenes protein hibrid előállítására, amelynek egyik része lényegében megfelel egy tumor-ellenes immunoglobulin Fab fragmentumának, másik része pedig lényegében egy diftéria toxin A fragmentumával egyezik meg. A találmány szerint előállítható tumor-ellenes protein hibrid az (I) általános képlettel írható le Fab-Sj <X)n-Sa-Fa (I), ahol n Fab olyan molekularészt jelöl, amely lényegében megegyezik egy tumor-ellenes immunoglobulin FAB fragmentumával, FA olyan molekularészt jelöl, amely lényegében azonos egy diftéria toxin A fragmentumával, X (A) képletű csoportot jelent, S, és Sj egyaránt kénatomot jelent, ahol Sj egy immunoglobulin -S-S- kötéséből származó kénatomot jelöl, míg S2 egy diftéria toxin -S-S- kötéséből származó kéntatomot képvisel, n értéke 0 vagy 1. A találmány szerint az (I) általános képletű tumorellenes protein hibridet úgy állítjuk elő, hogy a Fab fragmentum kénatomját közvetlenül vagy közvetve összekapcsoljuk az A fragmentum kénatomjával. Az l.(a) ábra az immunoglobulinok alapszerkezetének egy lehetséges felépítését mutatja, az 1 ,(b) ábra pedig az emberi IgGl immunoglobulin szerkezetét szemlélteti. Az ábrán L-lel az úgynevezett könnyű láncokat, H-val pedig az úgynevezett nehéz láncokat jelöltük. Fc pedig a Fragment crystalline angol kifeje184.736 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
