184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 zés rövidítése, és a molekula nem specifikus részét jelöli. A 2. ábrán a diftéria toxin alapszerkezetét szemléltetjük, ahol az (a) ábra mutatja az intakt toxin szerkezetét, a (b) ábra mutatja egy bemetszett toxin szerkezetét, a (c) ábra pedig az A és B fragmentum szerkezete látható. A 3. ábra — . — vonallal jelölt görbéje an ti L121Q immunoglobulin IgGl FabJ fragmentuma és a diftéria toxin A fragmentuma reakciótermékének eluálási görbéjét mutatja, Sephadex F 150 superfine kromatográfiás oszlopon végzett eluálás után. A —jelű görbe az EF-2 ADP ribóz transzferáz aktivitását és a ábra a Fab’ fragmentum koncentrációját mutatja. A 4. ábrán az elektroforézis mozgási sebesség átalakulását ábrázoljuk, nátrium-dodecl-szulfát felhasználása esetén. Az 5. ábrán ismét egy eluálási görbe szerepel. Közelebbről s az L1210 immunoglobulin IgGl PDM maradéka Fab fragmentumának és a diftéria toxin A fragmentumának reakciójával létrejött termék Sephadex G150 superfine kromatográfiás oszlopon felvett eluálási görbéjét ábrázoljuk. A 6. ábra az 5. ábra 1, 2 és 3 csúcsain található protein analízis eredményeit mutatja, Uchterlony módszerrrel meghatározva tengeri malacot nyúl Fab’ fragmentumával immunizálva előállított ellenanyagot és ló anti-diftéria toxin ellenanyagot használva, A 7. ábrán az antitumor protein hibrid citotoxicitásának mérési eredményeit mutatja L1210-el szemben, az idő függvényében. A jelen találmányban tumor-ellenes immunoglobulinnak nevezett anyag egy olyan protein (immunoglobulin), amely ellenanyag hatással rendelkezik (azaz olyan természetű, hogy felismeri a tumor antigéneket és hozzájuk kapcsolódik). Előállítása például egy rákos beteg szérumából vagy majmok, lovak, tehenek, birkák, nyulak szérumából történik, ahol a felsorolt állatokat ráksejtekkel vagy rák antigénnel Cohn etanol frakcionálási módszerével, ammónium-szulfát frakcionálási módszerrel, ion-cserés kromatográfiával vagy bármely más közismert módon hiperimmunizálták. Vagy olyan proteinről van szó, amely hybridomákból vagy hybridomákkal inokulált állatok szérumából vagy hasvízéből kapott rák antigénnel szemben erősen szelektív antitest hatással rendelkezik, ahol az alapanyag előállítása úgy történik, hogy ellenanyagot termelő limfocitákat, amelyeket úgy nyertünk, hogy állatokat rák sejtekkel vagy rák antigénnel immunizáltunk, például myelomával kapcsoljuk (lásd például H. Koprowski és mtsai: Prox. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 7, 3405-3409 /1978/), K.E. Hellström és mtsai: Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 76, 6 2927-2931 /1979/, R.H. Kennett és mtsai: Science 203,1120-2212/1979/). Az immunoglobulinoknak jól ismert módon különböző főbb csoportjai ismertek. Ilyenek például az IgG, IgA, IgD és IgE. Valemennyire jellemző, hogy alapszerkezete, amint az l.(a) ábrán látható, két L láncot és két H láncot tartalmaz, és a láncokat legalább három diszulfid-kötés köti össze. így például az 1 .(a) ábrán látható immunoglobulin két Fab részből áll. és Fc részt tartalmaz. A Fab részek ellenanyagként hatnak, azaz szelektív antigén-kötő képességgel rendelkeznek, az Fc rész a komplementerekhez vagy a sejtfalon levő Fc receptorokhoz kötődik. Az a molekularész, amely lényegében a Fab fragmentumból áll — amely a találmány szerinti tumorellenes hibrid egyik molekularésze is - annak a molekularésznek felel meg, amely az ellenanyag hatású, az immunoglobulin említett Fab részéből származó fragmentumot tartalmazza. így például, ismert, hogy az IgGl, amely tipikus emberi immunoglobulin, az l.(b) ábrán bemutatott vázlatos alapszerkezettel rendelkezik. Ismert az is, hogy ez az immunoglobulin a cisztin jelenlétében végrehajtott papain emésztés hatására az A-A’ szaggatott vonal mentén két Fab fragmentumra és egy Fc fragmentumra hasad (lásd az 1 .(b) ábrát), és az így kapott Fab fragmentumok felhasználhatok a jelen találmány céljára. Ha az IgGl-t pepszinne^ kezelj ük, az l.(b) ábrán bemutatott módon a B-B’ szaggatott vonal mentén felhasad, és egy (F(ab')j) dimer jön létre, amely két Fab’ részből épül fel, ahol a Fab’ rész egy Fab fragmentumból és az ábrán satirozással jelölt csuklórészből épül fel. A Fab fragmentumhoz úgy is eljuthatunk, hogy a csuklórészben levő diszulfid-kötést reduktiven hasítjuk, például egy tiol-reagens felhasználásval, vagy szulfit-ionokkal szulfonáljuk. Miután a Fab’ fragmentum a Fab fragmetumhoz hasonlóan ellenanyagként hat (bár nem hajlamos komplementekhez való kapcsolódásra), a találmány szerinti eljárásban szintén felhasználható Fab fragmentumként. A találmány szerint tehát, ha a Fabt fragmentum ellenanyag hatást mutat, a Fab és Fab fragmentumok egyaránt felhasználhatók. Az így kapott, általános értelemben vett Fab fragmentumot közvetlenül felhasználhatjuk a találmány szerinti tumor-ellenes protein hibrid előállítására, feltéve, hogy legalább egy tiol-gyököt (-SH) és/vagy S-szulfo-gyököt (-S-SO,-) tartalmaz. Ha ezt a feltételt nem teljesíti, úgy járhatunkel, hogy a kiindulási anyagot legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmazó fragmentummá alakítjuk úgy, hogy a láncokon (H vagy L láncokon) lévő és a láncok közötti (a H láncok és az L láncok közötti) diszulfid kötések legalább egyikét lehasítjuk, általános ismert módszerekkel. A tiol -gyökök és/vagy S-szulfo-gyökök száma a Fab fragmentumban előnyösen 1-5, különösen előnyös pedig, ha a láncok közötti kötések felhasadásával keletkező tiol- és/vagy S-szulfo-gyökök száma 1 vagy 2. A bejelentésben diftéria toxinnak nevezett anyag egy protein toxin, amelyet a Crynebacterium diphteriae vagy mutánsa termel. így például a Corynebacterium diphteriae által termel diftéria toxin egy polipeptid láncból áll, amelynek molekulasúlya körülbelül 62 000-63 000. Ezt a toxint intakt toxinnak nevezzük. Az intakt toxin molekulája, a 2.(a) ábrán bemutatott módon két diszulfid-kötést tartalmaz. Ha ezt az intakt toxint enyhe körülmények között egy proteolitikus enzimmel, például tripszinnel kezeljük, az amino-terminális véghez közelebb, egy meghatározott ponton elkülönülés történik, és egy úgynevezett bemetszett toxin jön létre (lásd 2.(b) ábra). Ha ezt a bemetszett toxint redukálószerrel kezeljük, szétbomlik egy A fragmentumra, amelynek molekulasúlya körülbelül 24 000 és egy B fragmentumra, amelynek molekulasúlya körülbelül 38 000-39 000 (lásd 2.(c) ábra). Az intakt toxin állatokkal szemben erősen toxikus, az A és B fragmentum külön-külön azonban nem toxikus. Másrészt, az intakt toxin nem rendelkezik adenozin-difoszfát (ADP)-robóz transzfe-184.736 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
