184704. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin analógok előállítására
sen izotoniásak a recipiens vérével. Az ilyen készítményt úgy állíthatjuk elő, hogy a szilárd hatóanyagot vízben oldjuk, hogy vizes oldatot kapjunk, majd az oldatot sterilizáljuk és a beteg vérével izotoniássá alakítjuk. A készítményeket egységnyi vagy multi-dózisú tartóban, például lezárt ampullában vagy fiolában tároljuk. A nazális adagolásra alkalmas készítményekben a hordozó durva, 20—500 mikron részecske nagyságú por, amelyet orron keresztül kell felszívni, például az orrsövényen történő gyors inhalálás útján, a port tartalmazó üveget az orrhoz közel tartjuk. A fent felsorolt komponenseken kívül a készítmények tartalmazhatnak még egy vagy több komponenst, mind például hígítót, puffert, ízesítő szert, kötőanyagot, felületaktív anyagot, sűrítőt, csúsztatószert, tartósítószert (beleértve az antioxidánsokat is) stb. Ha a készítményt akár humán vagy állatgyógyászati célokra egységdózis formájában állítjuk elő, az egyes egységnyi dózisok a hatóanyagot 0,125 pg-2 g, előnyösen 1,25 jug-200 mg és adott esetben 12,5 pg-20 mg mennyiségben tartalmazzák (valamennyi súlyt a pepiid bázisra vonatkoztatjuk). A találmány további részleteit a következő nem korlátozó jellegű példákkal szemléltetjük. A következő rövidítéseket alkalmazzuk: HOBT 1-hidroxibenzotriazol DCCI diciklohexilkarbodiimid DCU diciklohexilkarbamid NMM N-metil-morfolin DMF dimetilformamid Pr izopropanol Pr2 0 diizopropiléter pe petroléter EtOAc etilacetát Z benziloxikarbonilcsoport Bu tercier butilcsoport BOC tercier butiloxikarbonilcsoport Bzl benzilcsoport. A peptideket Merck szilikagél lemezeken a következő oldószerrendszerrel vékonyrétegkromatografáljuk: 1. metiletilketon 2. n-butanol:ecetsav:víz (3:1:1) 3. kloroform metanol :3 2% ecetsav (12:9:4) 4. kloroform :metanol:880 ammónia (12:9:4) 5. etilacetát:n-butanol:ecetsav:víz (1:1:1:1) 6. kloroform:metanol (8:1). Ellenkező megjegyzés hiányában az aminosavak L-konfigurációjúak. Az optikai forgatóképességet Bendix NPL automatikus polariméteren határoztuk meg. A peptid-hidrolizátumok aminosav összetételét Beckman-Spinco Model 120 °C aminosav analizátorral (6 n sósavval 110 °C-on 24 óra hosszat evakuált lezárt kémcsövekben) vagy Rank Chromostak aminosav analizátorral határoztuk meg. A peptidek szintézisénél általában a következő módszereket követtük: a) A kapcsolást DMF-ben végeztük és DCCI-t használtunk kapcsolószerként. b) Az aminosav-észter-hidrokloridokat szabad észterekké alakítjuk tercier bázis, például trietilamin vagy N-metil-morfolin hozzáadásával. c) HOBT-t adunk hozzá a kapcsolási stádiumban, ha a részkondenzációban egy optikailag aktív karboxil-terminális aminosavat tartalmazó peptid vesz részt, amely BOC.Tyr.D-Ala.Gly.Phe.OH-val kapcsolódik. d) A kapcsolás 24 óráig tart hideg szobában 4 °C- on. e) Kapcsolás után a tisztítást úgy hajtjuk végre, hogy a nem-reagált részek eltávolítására savval és bázissal mossuk az elegyet. f) Lúgos elszappanosítást hajtunk végre vizes metanolban egy autotitrálóval pH = 11,5-12,0 mellett n nátriumhidroxiddal. g) A benziloxikarbonil védőcsoportokat metanol és ecetsav elegyével hidrogenolízis útján 10% palládiumot tartalmazó aktív szén katalizátor jelenlétében eltávolítjuk. h) a fenti hidrogenolízissel kapott acetát-sókat a megfelelő metanolos sósav hozzáadásával hidrokloridokká alakítjuk. i) a benzil-védőcsoportokat metanolban 10% palládiumot tartalmazó aktív szén jelenlétében végzett hidrogenolízissel távolítjuk el. j) A tercier butil- és tercier butiloxikarbonil védőcsoportokat n sósav ecetsav tisztítóanyag jelenlétében távolítjuk el. A lehasítás 60-90 percig folyik. k) A treonin és szerin alkoholos csoportjait védő OBu védőcsoportokat 10% vizet tartalmazó trifluorecetsawal távolítjuk el, a lehasítás 90 percig tart. l) A végső peptideket hidrokloridjuk formájában izoláljuk és vizes oldatukból lioíilizáljuíc. 1. Referencia-készítmény BOC.Tyr.Gly.Gly.Phe.OH Az 1. táblázatban ábrázolt séma szerint állítjuk elő, ahol a különböző védőcsoportok jelentése a következő: Z: benziloxikarbonil Me: me til BOC: t-butiloxikarbonil. Valamennyi kapcsolást diciklohexilkarbodiimid alkalmazásával dimetilformamidban végzünk, a reakcióelegyet 4 °C-on legalább 24 óráig keverjük. A peptid metilésztereket (1), (5) metanol és víz 3:1 térfogatarányú oldatában 2 n vizes nátrium-hidroxid hozzáadásával pH = 11,5 mellett (pH -sztattal mérve) elszappanosítjuk. A Z védőcsoportot metanolban végzett hidrogenolízissel 10% palládium/aktív szén jelenlétében lehasítjuk a (3) védett tripeptidről. A 2. táblázat tartalmazza a jellemző adatokat, ahol Rf Merck-szilikagélen és a megjelölt oldószer-rendszerekkel végzett vékonyrétegkromatográfiára vonatkozik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
